乳腺癌WWOX基因CpG島甲基化和肼苯噠嗪去甲基化的實驗研究.pdf

1、乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，抑癌基因和癌基因的異常表達是乳腺癌發(fā)生的重要機制。WWOX(WW domain containing oxidoreductase)基因是跨越了整個常見染色體脆性位點FRAl6D的一個新的抑癌基因，2000年由Bednarek等應用鳥槍基因測序技術結合對感興趣對應的轉錄子進行分離并分析的方法鑒定出的一個新基因，位于染色體16q23.3-24.1。研究發(fā)現，多種癌細胞中出現WWOX外顯子5-8或6-8的異常轉錄

2、，提示WWOX是另一種具抑制腫瘤生長的基因，在基因組和轉錄水平影響這個基因的異?？赡芘c致癌性有關。研究發(fā)現在乳腺癌、卵巢癌和非小細胞性肺癌中存在著WWOX的表達降低，WWOX基因在多種腫瘤組織及細胞系中出現頻發(fā)雜合性丟失、mRNA異常轉錄子及WWOX蛋白表達異常等證明WWOX屬于抑癌基因。 WWOX蛋白含有414個氨基酸，其氨基末端有兩個WW結構域，而WW結構域的功能主要與蛋白之間的相互作用有關。在WWOX蛋白的中心部位有一短鏈

3、氧化還原酶功能域(short-chain dehydrogenase/reductase domain，SRD)，SRD具有特異性酶的功能。因此，WWOX可能在雌二醇和雌激素受體相互作用的調節(jié)中發(fā)揮了作用。 抑癌基因在基因組和轉錄水平的異常表達是腫瘤發(fā)生的常見原因，WWOX基因失活機制可能有：①WWOX等位基因雜合子缺失及純合子缺失[4]；@WWOX基因mRNA轉錄缺失或嚴重降低，導致表達缺失或降低；③DNA調控區(qū)CpG島甲基化

4、。WWOX基因與脆性三聯(lián)組氨酸(FHIT)基因的mRNA表達有相關性[5]。文獻報道胰腺癌中WWOX基因的表達缺失與DNA調控區(qū)CpG島的甲基化有關。近年來腫瘤基因甲基化的研究之所以受到腫瘤研究者的重視，原因在于：(1)基因調控區(qū)域的CpG島的甲基化與各種基因(包括抑癌基因)表達的調控異常密切相關；(2)特異性CpG島的甲基化容易在癌癥患者個體以及高危人群的體液和組織中檢測到，因此特異性基因甲基化模式的研究有助于腫瘤診斷和預后預測；(3

5、)甲基化可以被特異性抑制劑所逆轉，提示這一類型的抑制劑可以應用于臨床治療。研究發(fā)現肼苯噠嗪能作為去甲基化藥物恢復T淋巴細胞功能相關抗原、誘導出P16基因啟動子甲基化的乳腺癌細胞系的P16基因mRNA和蛋白質表達[69]，在腫瘤治療中顯示出良好的應用前景[71]。 本研究目的：①通過檢測乳腺癌和癌旁乳腺組織中WWOX蛋白的表達，并與ER、PR、HER-2/neu、絕經狀態(tài)及臨床分期等臨床病理學指標進行分析；通過逆轉錄酶聯(lián)聚合反應(

6、RT-PCR)檢測乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞系以及乳腺癌標本WWOX基因mRNA的表達；②應用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)檢測乳腺癌中WWOX基因表達異常與DNA調控區(qū)(啟動子及第一外顯子)CpG島甲基化狀態(tài)的關系；③應用肼苯噠嗪對MDA-MB-231、MCF-7細胞進行處理，以5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)作

7、為陽性對照，觀察肼苯噠嗪對于WWOX基因CpG島去甲基化、mRNA表達及癌細胞增殖活性的作用。 現將主要內容簡要介紹如下。 第一部分乳腺癌WWoX蛋白表達及其臨床意義 目的:檢測乳腺癌組織及細胞株中WWOX蛋白表達，并分析其與ER、絕經狀態(tài)及臨床分期等指標間的關系。 方法:應用免疫組織化學SP法檢測56例乳腺正常組織、12例DCIS和87例乳腺癌組織WWOX蛋白的表達，并與雌激素受體(ER)、孕激素受體(

8、PR)、HER-2/neu、絕經狀態(tài)及腫瘤分期等臨床病理學資料進行分析。應用免疫細胞化學法檢測MDA-MB-231、MCF-7細胞中WWOX蛋白的表達。 結果: 1.乳腺癌組織中WWOX蛋白表達顯著降低(62.1％)，與乳腺正常組織(28.6％)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)； 2.乳腺癌組織WWOX表達缺失與ER狀態(tài)關系密切，39.2％的ER陰性病例和28.8％的ER陽性病例中WWOX蛋白表達缺失，差異有統(tǒng)計

9、學意義(P：0.026)； 3.乳腺癌WWOX蛋白表達與絕經狀態(tài)相關，20.3％的絕經前病人和57.2％的絕經后病人中WWOX蛋白表達缺失，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)； 4. 晚期乳腺癌病人WWOX表達降低或缺失的比例增高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期病人中WWOX蛋白表達缺失的比例分別為23.1％、28.6％和46.2％，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)； 5.MDA-MB-231細胞WWOX蛋白染色明顯降低，而MC

10、F-7細胞呈現強染色： 6.WWOX蛋白表達與PR、HER-2/neu及腋窩淋巴結轉移等指標的關系無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 結論:乳腺癌中廣泛存在著WWOX蛋白的表達缺失，其異常表達與ER狀態(tài)、絕經狀態(tài)和腫瘤臨床分期關系密切，提示WWOX基因可能通過激素受體信號途徑在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。乳腺癌MDA-MB-231細胞WWOX蛋白低表達，而MCF-7細胞高表達。 第二部分乳腺癌組織和細胞株WWOX基

11、因調控區(qū)(啟動子和第一外顯子)CpG島甲基化狀態(tài)的研究 目的:探討乳腺癌組織和MDA-MB-231、MCF-7細胞株中WWOX基因調控區(qū)(啟動子和第一外顯子)CpG島甲基化狀態(tài)，并分析WWOX基因mRNA表達與CpG島甲基化狀態(tài)的關系。 方法:選取乳腺癌細胞株MDA-MB-23 1、MCF-7細胞、20例乳腺癌組織和10例癌旁組織為研究對象，通過WWOX基因DNA提取，應用CpGcnomeDNA修正盒進行DNA亞硝酸鹽修

12、飾，采用甲基化特異性PCR(methylation specificPCR,MSP)方法檢測乳腺癌組織和細胞系WWOX基因CpG島甲基化狀態(tài)；通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測WWOX基因mRNA表達，探討WWOX基因CpG島甲基化與mRNA表達的關系。 結果: 1.乳腺癌癌旁組織WWOX基因DNA調控區(qū)CpG無甲基化條帶表達； 2.20例乳腺癌組織中，11例中出現WWOX基因啟動子CpG島甲基化擴增

13、，甲基化率為55％，其中4例為完全甲基化(僅甲基化引物擴增出目的基因)，7例為部分甲基化(甲基化引物和非甲基化引物均擴增出目的基因)。9例中出現WWOX基因第一外顯子CpG島甲基化擴增，甲基化率為45％，其中4例為完全甲基化，5例為部分甲基化； 3.乳腺癌組織和癌旁組織中WWOX基因mRNA相對含量的平均值分別為1.18±0.11、2.1 4±0.12，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)； 結論:乳腺癌組織和細胞系存在著不

14、同程度的WWOX基因DNA調控區(qū)(啟動子和外顯子)CpC；島甲基化，是導致WWOX基因表達缺陷的原因之一。WWOX基因調控區(qū)CpG島甲基化的乳腺癌組織WWOX mRNA表達明顯降低，提示DNA甲基化是乳腺癌WWOX基因mRNA表達缺陷的重要機制。 第三部分肼苯噠嗪對乳腺癌細胞WWOX基因CpG島去甲基化作用的實驗研究 目的:探討肼苯噠嗪能否發(fā)揮去甲基化作用，誘導乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞 mRNA及蛋白表

15、達，并抑制細胞增殖。 方法:肼苯噠嗪處理MDA-MB-231、MCF-7細胞，以5-Aza-CdR作為陽性對照，MSP檢測WWOX基因CpG甲基化狀態(tài)；RT-PCR分析藥物處理組、對照組WWOX因 mRNA及蛋白表達變化：采用細胞計數法繪制細胞生長曲線，噻唑藍(MTT)法測定細胞抑制率，分析肼苯噠嗪處理前后乳腺癌細胞的生長變化。 結論:肼苯噠嗪可以發(fā)揮去甲基化作用，誘導MDA-MB-231細胞WWOX基因mRNA及蛋白表

16、達，并抑制細胞增殖活性。1.0、2.0、4.0、6.0μmol/L等濃度的5-Aza-CdR處理MDA-MB-231細胞后，在去甲基化、恢復WWOX基因mRNA和蛋白表達以及降低癌細胞增殖等方面作用無顯著性差異。 乳腺癌中廣泛存在著WWOX基因的表達缺失，其異常表達與ER狀態(tài)、絕經狀態(tài)和腫瘤臨床分期關系密切，提示WWOX基因可能是通過激素受體信號途徑在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。乳腺癌組織中存在不同程度的WWOX基因啟動子和第

17、一外顯子CpG島的完全甲基化和部分甲基化，且WWOX基因mRNA表達降低，提示CpG島甲基化是乳腺癌WWOX基因tuRNA表達缺陷的重要機制。MDA-MB-231細胞中，WWOX基因啟動子和第一外顯子CpG存在著完全甲基化，WWOX基因mRNA及蛋白表達明顯降低。MCF-7細胞無WWOX基因CpG島甲基化，WWOX基因mRNA及蛋白高表達。10μmol/L肼苯噠嗪和1.0、2.0、4.0、6.0μmol/L的5-Aza-CdR對MDA-