乳腺癌多藥耐藥基因ABCG2表達與DNA甲基化研究.pdf

1、1.研究背景: 乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率有逐年上升趨勢。目前，手術是乳腺癌治療的主要手段，但化學藥物治療也是乳腺癌綜合治療一個不可缺少的重要方法，尤其晚期乳腺癌，可在術前、術中及術后進行全身性或區(qū)域性輔助化學治療。然而，乳腺癌細胞對化療藥物易產(chǎn)生多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，即由一種藥物誘發(fā)，但同時又對其他多種結構和作用機制迥異的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥，是影響藥物療效及病

2、人預后的主要原因。 腫瘤多藥耐藥存在多種機制，其中以ABC轉運蛋白超家族(ATP—binding cassette transporter superfamily)成員介導的細胞內藥物外排在MDR中起了重要作用，也是目前國內外研究的熱點之一。該家族中與藥物耐受密切相關的蛋白有：由多藥耐藥基因MDR1 (multidrug resistance 1)所編碼ABCB1，又名P—糖蛋白(P—glycop rotein，P—gp)和AB

3、CC1，又名多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance p rotein，MRP1)，以及新近發(fā)現(xiàn)的由ABCG2基因編碼的乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)又名(ABCG2/MXP/ABCP)。 雖然ABCG2基因具有一定的生理功能，但其過表達?？山閷γ淄休祯負涮婵?，氨甲喋呤等的抗癌藥物的耐受。研究表明，多藥耐藥基因ABCG2在乳腺癌中有表達，化療常

4、引起其過表達，導致多藥耐藥，影響了乳腺癌的治療療效及病人預后。目前，對該基因表達的分子機制尚不清楚?；蚪Y構分析發(fā)現(xiàn)，該基因啟動子區(qū)存在多種轉錄因子結合位點，并含有豐富的甲基化島及正性和負性調控區(qū)域。MDR1基因啟動子區(qū)同樣存在豐富的甲基化島，且其表達與DNA甲基化密切相關，同時，有研究表明ABCG2表達與DNA甲基化有關，但在乳腺癌中的研究目前尚無。 因此，本研究擬用米托蒽醌染毒，以建立不同耐藥程度的MCF—7/Mit耐藥細胞

5、株，收集術前化療與未化療的乳腺癌組織標本，進行體內外實驗研究，初步探討乳腺癌多藥耐藥ABCG2基因表達與DNA甲基化的關系，為逆轉由ABCG2蛋白引起的腫瘤多藥耐藥提供新的靶點，以提高腫瘤病人的化療療效，最終改善腫瘤病人的生存質量。 2.方法: 2.1以終濃度為0.005，0.01，0.02，0.04，0.08μM的米托蒽醌，由低濃度開始，對人乳腺癌細胞MCF—7持續(xù)染毒，并連續(xù)換次高濃度染毒。每個濃度持續(xù)染毒30天，誘

6、導細胞耐藥。觀察細胞形態(tài)變化，并繪制細胞生長曲線。 2.2以未染毒的MCF—7為對照，用流式細胞術檢測該不同染毒濃度MCF—7細胞對米托蒽醌的耐藥性，并用CCK—8法檢測其對米托蒽醌，阿霉素及肽素的耐受性。 2.3以免疫熒光，Q—PCR及WesternBlot方法檢測不同耐藥程度的MCF—7/Mit中ABCG2的表達。同時，用Q—PCR方法檢測4μM5-aza—dC染毒72h的MCF—7細胞中ABCG2mRNA表達，作為

7、陽性對照。 2.4以高效毛細胞管電泳法檢測MCF—7/Mit耐藥細胞中全基因組甲基化水平，并通過甲基化特異性PCR(MSP)法檢測了ABCG2基因啟動子區(qū)甲基化狀況。用4μM5-aza—dC染毒72h的MCF—7細胞作為陽性對照。 2.5以Q—PCR及WesternBlot方法檢測了MCF—7/Mit中DNMT1，DNMT3A及DNMT3B的表達水平。同時，以Q—PCR方法檢測用4μM5-aza—dC染毒72h的MCF—

8、7細胞作為陽性對照。 2.6以Q—PCR檢測了術前化療與未化療的乳腺癌組織中ABCG2及DNMT1，DNMT3A和DNMT3BmRNA表達水平；MSP法檢測ABCG2啟動子區(qū)甲基化狀況。 3.結果: 3.1初次染毒及初次換次高濃度的米托蒽醌染毒時，細胞死亡較多，細胞生長緩慢。從低劑量到高劑量染毒，形態(tài)出現(xiàn)一定的變化，且細胞生長相對緩慢。 3.2隨著米托蒽醌染毒劑量的增加，MCF—7細胞的耐藥性增大；對米托

9、蒽醌的耐藥性最大，對阿霉素和肽素的耐藥性相似。以0.02μM階段組MCF—7細胞變化開始明顯。 3.3ABCG2蛋白主要表達于細胞膜上，且隨MCF—7/Mit耐藥性的增加，表達增加，并在0.02階段組ABCG2表達變化開始顯著。 3.4與未染毒的MCF—7細胞相比，MCF—7/Mit細胞中全基因組呈低甲基化趨勢，選定的ABCG2啟動子區(qū)個別位點呈高甲基化趨勢。 3.5MCF—7/Mit耐藥細胞株中，DNMT1，D

10、NMT3A及DNMT3B表達呈降低趨勢，以DNMT3B變化最明顯，DNMT1次之。 3.6以術前未化療的乳腺癌組織為對照，術前化療的乳腺癌組織中，ABCG2mRNA呈高表達趨勢；所選定的ABCG2啟動子區(qū)個別位點呈高甲基化趨勢；DNMT1，DNMT3A及DNMT3B呈低表達趨勢，以DNMT3B表達變化明顯。 4.結論: (1)本實驗室已成功構建了不同耐藥程度的MCF—7/Mit耐藥細胞株，為ABCG2蛋白介導耐藥