ABCG2、HiF-2a在乳腺癌中的表達及其與多藥耐藥關(guān)系的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　在世界范圍內(nèi)，乳腺癌已是目前女性最常見的惡性腫瘤。在我國，乳腺癌近10年的發(fā)病率增加了30％。因此如何準確判斷乳腺癌患者預后，以及如何選擇合理有效的治療成為目前乳腺癌研究的重點。
　　目前，大家公認的與乳腺癌患者預后相關(guān)的指標包括病人年齡、腫瘤組織學類型、組織學級別、腫瘤大小、腫瘤細胞增殖活性(ki67)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、雌孕激素受體(ER、PR)以及酪氨酸激酶生長因子受體2(Her-2，或C-erbB

2、-2)的表達水平等臨床病理學指標。在治療方面，手術(shù)切除腫瘤仍是乳腺癌治療的主要方法，此外，很多病人還接受術(shù)后輔助治療，以期減少局部及遠處腫瘤復發(fā)的風險。為了得到最佳的治療效果，減少治療的毒副作用，輔助治療可選擇化療、放療、內(nèi)分泌及靶向治療等。化療在乳腺癌治療中起重要作用，但研究表明，約90％的乳腺癌患者化療失敗歸咎于多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，因此MDR成為困擾乳腺癌治療的難題之一。MDR由多種因素誘導

3、，在一些耐藥相關(guān)蛋白的作用下將藥物從腫瘤細胞中泵出，腫瘤細胞內(nèi)藥物濃度降低，導致藥物毒性下降，這些耐藥相關(guān)蛋白都是膜蛋白，均屬于ATP結(jié)合的盒式(ATP bindingcassette，ABC)運輸?shù)鞍准易濉?br>　　缺氧是實體腫瘤進展的重要因素，而且與腫瘤細胞代謝、血管生成和轉(zhuǎn)移的多個指標都密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)廣范缺氧的存在使放療或化療后生存率降低，而且缺氧與有很多腫瘤的預后不良密切相關(guān)。組織對缺氧的反應主要是通過缺氧誘導因子

4、(Hypoxia-Inducible Factor，Hif)，Hif-1a和Hif-2a來介導的。盡管這兩種蛋白高度同源，但他們有不同的調(diào)控靶基因，并對腫瘤的生長起不同的作用。Karolina等研究發(fā)現(xiàn)Hif-2a與乳腺癌的不良預后有關(guān)，但沒有發(fā)現(xiàn)Hif-1a有這種關(guān)系。
　　ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member2，或breast cancerresistance prote

5、in，BCRP)，是ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族中的成員之一，是一種重要的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，在多藥耐藥方面有著不可忽視的地位。目前對ABCG2結(jié)構(gòu)、功能及其在多藥耐藥中的作用均進行了大量研究。研究表明，ABCG2啟動子有兩個功能區(qū)，分別是雌激素反應元件（estrogen response elements，ERE）及缺氧反應元件（hypoxia response elements，HRE）。啟動子通過激活ABCG2基因上游的PPARg(peroxi

6、some proliferator-activated receptor g)反應元件來控制ABCG2的表達。
　　目前關(guān)于ABCG2及Hif-2a蛋白在乳腺癌細胞中的表達及其與前述乳腺癌相關(guān)臨床病理指標的相關(guān)性的研究還未見報道。而ABCG2啟動子有雌激素反應元件和缺氧反應元件兩個功能區(qū)，提示我們ABCG2可能與ER等乳腺癌臨床病理指標及Hif-2a等缺氧誘導因子存在相關(guān)性或調(diào)控關(guān)系。故我們在這些方面進行研究。
　　在本研究

7、中，我們首先采用組織芯片及免疫組化技術(shù)，分別檢測196例人乳腺癌手術(shù)切除石蠟包埋標本中ABCG2及Hif-2a的表達，并對應用統(tǒng)計學方法分別分析ABCG2、Hif-2a的表達與前述乳腺癌臨床病理指標（年齡、組織學類型、組織學級別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、ER、PR、HER2以及Ki67等）及其ABCG2與Hif-2a之間的相關(guān)性，探討ABCG2與啟動子功能區(qū)相關(guān)的ER及Hif-2a蛋白在乳腺癌細胞中的表達及其是否存在相關(guān)性。繼而

8、，根據(jù)相關(guān)性研究的結(jié)果，構(gòu)建能夠持續(xù)特異性沉默Hif-2a表達的重組質(zhì)粒pSUPER-siHif-2a，同時以隨機干擾序列重組質(zhì)粒pSUPER-siN為對照，分別轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞株MCF-7及T47D。應用RT-PCR、Western Blot、MTT等技術(shù)方法檢測干擾Hif-2a后，ABCG2 mRNA、蛋白質(zhì)及細胞耐藥性的變化，探討Hif-2a與ABCG2之間可能的調(diào)控關(guān)系，并提出在乳腺癌細胞內(nèi)ABCG2可能是Hif-2α直接調(diào)節(jié)的

9、下游靶基因這一論斷。
　　實驗方法：
　　1、研究病例標本及組織芯片的制作
　　選取山東大學齊魯醫(yī)院病理科存檔的臨床病理資料完整的196例浸潤性導管癌蠟塊，每例選取兩個典型部位制作成組織芯片。
　　2、免疫組化及相關(guān)性分析
　　采用免疫組織化學二步法（PV-9000法）檢測196例原發(fā)性乳腺浸潤性導管癌組織中ABCG2及Hif-2a的表達情況，并設定染色強弱的判定標準，應用統(tǒng)計學分析了ABCG2及Hif-2

10、a的表達與上述乳腺癌臨床病理指標之間的相關(guān)性，以及ABCG2表達與Hif-2a表達的相關(guān)性。
　　3、構(gòu)建沉默Hif-2a表達的干擾質(zhì)粒
　　分別設計并合成針對Hif-2a基因的雙鏈干擾RNA序列以及作為對照的非靶向性干擾序列，將其定向插入到質(zhì)粒載體pSUPER.neo+GFP中，構(gòu)建穩(wěn)定表達載體pSUPER-siHif-2a和pSUPER-siN。酶切及測序鑒定正確后，大量擴增。
　　4、細胞系的檢測:
　　應

11、用RT-PCR、qRT-PCR、Western Blot等方法檢測本實驗室培養(yǎng)的人乳腺癌細胞系MCF-7及T47D中ABCG2及Hif-2a的mRNA水平及蛋白水平。
　　5、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:
　　構(gòu)建的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)48h后，通過RT-PCR及qRT-PCR檢測各組細胞中Hif-2a mRNA和ABCG2 mRNA的表達情況，應用Western blot檢測Hif-2a蛋白和ABCG2蛋白表達情況。應用MTT法

12、檢測各組細胞對米托蒽醌的半數(shù)細胞抑制濃度(IC50)的改變，評價干擾Hif-2a對細胞多藥耐藥性的影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1、免疫組化結(jié)果:
　　ABCG2免疫組化染色，著色部位為細胞漿及細胞膜。在乳腺浸潤性導管癌的腫瘤組織內(nèi)，ABCG2表達強弱不等分布不均。15例（占7.7％）為完全陰性，80例（占40.8％）為陽性+，77例（占38.2％）為陽性++，24例（占12.3％）為陽性+++。按照ABCG2表達高低的

13、計算方法，結(jié)合陽性腫瘤細胞的比率，196例病例中，73例（占37.2％）ABCG2高表達，97例（占49.5％）低表達，26例（占13.3％）為陰性。
　　Hif-2a免疫組化染色，著色部位在細胞核。在乳腺浸潤性導管癌的腫瘤組織內(nèi)，Hif-2a表達強弱不等分布不均。12例（占6.12％）為完全陰性，78例（占39.80％）為陽性+，69例（占35.20％）為陽性++，37例（占18.88％）為陽性+++。按照Hif-2a表達高低的

14、計算方法，結(jié)合陽性腫瘤細胞的比率，196例病例中，57例（占29.08％）Hif-2a高表達，114例（占58.16％）低表達，25例（占12.76％）為陰性。
　　2、ABCG2及Hif-2a的表達與乳腺癌臨床病理指標之間的相關(guān)性，以及ABCG2表達與Hif-2a表達的相關(guān)性。
　　統(tǒng)計分析表明，在乳腺浸潤性導管癌細胞中ABCG2蛋白表達與HER-2表達明顯正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期也有明顯相關(guān)性。ABCG2蛋白表達水

15、平與下列臨床病理學指標未見明顯相關(guān)性:病人年齡、組織學亞型、組織學分級、腫瘤大小、ER、PR、以及Ki67。
　　統(tǒng)計分析表明，在乳腺浸潤性導管癌細胞中Hif-2a蛋白表達與組織學分級及Ki67水平均有明顯相關(guān)性。而且Hif-2a蛋白表達與ABCG2表達明顯正相關(guān)。Hif-2a蛋白表達水平與下列臨床病理學指標未見明顯相關(guān)性:病人年齡、組織學亞型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、ER、PR、以及HER-2。
　　3、轉(zhuǎn)染干擾H

16、if-2a的質(zhì)粒pSUPER-siHif-2a后相關(guān)實驗結(jié)果
　　干擾Hif-2a的質(zhì)粒pSUPER-siHif-2a轉(zhuǎn)染后，MCF-7/pSUPER-siHif-2a及T47D/pSUPER-siHif-2a細胞中，Hif-2a基因的mRNA水平及蛋白表達水平均明顯降低，證明干擾效果良好。而在干擾后細胞中ABCG2的mRNA水平及蛋白表達水平也明顯減低，說明Hif-2a與ABCG2之間可能存在直接或間接的調(diào)控關(guān)系。MTT法檢測細

17、胞對化療藥物的耐受性，發(fā)現(xiàn)干擾組細胞對米托蒽醌的IC50明顯降低，相對耐藥指數(shù)顯著下降，耐藥性被不同程度逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：
　　1、ABCG2表達于大多數(shù)(86.7％)乳腺浸潤性導管癌細胞中，其中40％的病例為高表達。而且ABCG2蛋白的表達與浸潤性導管癌HER2表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有顯著相關(guān)性。提示ABCG2不僅是一種耐藥相關(guān)蛋白，而且可能是一種能夠預測乳腺癌生物學行為、臨床侵襲性，判斷預后及化療效果的新的標記物。<

18、br>　　2、Hif-2α表達于大多數(shù)(87.24％)乳腺浸潤性導管癌細胞中，其中29.08％的病例為高表達。而且Hif-2α蛋白表達與浸潤性導管癌中ABCG2蛋白的表達以及組織學分級、Ki67表達均有明顯相關(guān)性。提示Hif-2α不僅是一種缺氧誘導因子，而且可能是一種能夠預測乳腺癌惡性生物學行為以及化療效果不良的新的標記物。
　　3、在乳腺癌細胞內(nèi)，ABCG2的mRNA水平及蛋白表達水平隨著Hif-2α的改變而改變，與Cindy