山羊印記基因H19、Dlk1、CLPG和毛囊發(fā)育相關(guān)基因Dkk1的研究.pdf

1、本研究可以分兩個(gè)部分： 第一部分：山羊印記基因H19、Dlk1、CLPG的研究 基因組印記是一種依賴(lài)于親本的基因表達(dá)形式，導(dǎo)致功能基因單一表達(dá)一個(gè)等位基因而不表達(dá)另一個(gè)等位基因，造成印記位點(diǎn)的單等位表達(dá)，是一種基因表達(dá)的正常形式。雖然印記基因在哺乳動(dòng)物基因組中只占一小部分，但在胚胎生長(zhǎng)和行為發(fā)育中都起了關(guān)鍵作用。 人和小鼠的H19和Dlkl是印記基因，但是山羊的H19和.Dlkl的基因序列、基因結(jié)構(gòu)和印記狀態(tài)還不

2、清楚。 2002年，F(xiàn)reking等人發(fā)現(xiàn)一個(gè)位于Gtl2上游32.8kb的A-G的單堿基突變稱(chēng)CLPG突變。該突變可能是導(dǎo)致Callipyge綿羊表型的主要原因。山羊中是否也存在這樣的突變，導(dǎo)致“且巴臀山羊”成為本研究的一部分。 試驗(yàn)一：克隆了山羊H19部分序列，得到了1139bp的序列，該序列和綿羊、牛的同源性很高，分別為96.22％和90.51％，和豬、人、小鼠的同源性較低，分別為72.06％、59.64％和51.

3、83％。檢測(cè)了山羊胎兒和成年組織中H19的表達(dá)情況。H19在胎兒的大多數(shù)組織表達(dá)，出生后的表達(dá)在有些組織中受到限制，在成年山羊中在肝臟、肺、胰臟、背最長(zhǎng)肌、脾臟和腎臟中檢測(cè)到H19轉(zhuǎn)錄物。在H19外顯子5上找到一個(gè)SNP，通過(guò)檢測(cè)雜合子基因型和轉(zhuǎn)錄物及其父母基因型，發(fā)現(xiàn)H19在成年山羊組織中是父本印記表達(dá)。 試驗(yàn)二：克隆了山羊Dlkl部分cDNA序列，得到864bp，編碼287個(gè)氨基酸殘基，山羊DlklcDNA和氨基酸序列與其他

4、哺乳動(dòng)物的相應(yīng)序列有很高的同源性。Dlkl在胎兒大多數(shù)組織中表達(dá)，只在成年組織中的胰臟、胸腺和腎上腺表達(dá)。通過(guò)外顯子5上一個(gè)SNP，發(fā)現(xiàn)Dlkl在成年上述三種組織中都是父本表達(dá)，是一個(gè)母本印記基因。另外Dlkl在山羊成年組織中只存在兩種剪接變體Dlkl-C和Dlkl-C2。 試驗(yàn)三：克隆了山羊CLPG區(qū)250bp的片段，該片段和綿羊、豬的相應(yīng)片段有很高的同源性。用PCR-SSCP方法對(duì)波爾山羊、萊蕪黑山羊、魯波山羊、魯北自山羊和

5、白絨山羊進(jìn)行檢測(cè)，在“CLPG”突變處沒(méi)有發(fā)現(xiàn)A→G突變，在CLPG突變下游147bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)A→C的突變，稱(chēng)A216C位點(diǎn)，用PCR-RFLP方法檢測(cè)了上述5個(gè)山羊品種，其中魯波山羊群體中A等位基因頻率最高，魯北白山羊群體中A等位基因頻率最低，前四個(gè)群體中該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)，白絨山羊群體偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＜0.01)。產(chǎn)絨量、出生重、斷奶增重等性狀在該位點(diǎn)不同基因

6、型之間差異不顯著。 第二部分：毛囊發(fā)育相關(guān)基因Dkk1的研究；山羊Dkk1基因的克隆及多態(tài)性研究 Dkkl是Dkk家族成員之一，是Wnt信號(hào)途徑的拮抗物，參與多種生命過(guò)程。Dkkl可能通過(guò)抑制Wnt信號(hào)途徑參與毛囊密度的控制。本研究旨在尋找新的和出羊毛囊密度相關(guān)的基因，了解其作用機(jī)制，期望能夠用于提高山羊絨產(chǎn)量的分子育種。 克隆了山羊Dkkl基因，獲得3491bp序列，預(yù)測(cè)其mRNA和氨基酸序列，其mRNA和氨基

7、酸序列和其他哺乳動(dòng)物的相應(yīng)序列有很高的同源性。在自絨山羊群體中對(duì)3491bp序列進(jìn)行了SNP掃描，發(fā)現(xiàn)33處單核昔酸替代，內(nèi)含子2中一處4堿基插入。外顯子1中發(fā)現(xiàn)一處錯(cuò)義突變，命名為T(mén)1108P。檢測(cè)了T1108P位點(diǎn)在白絨山羊群體中的分布，結(jié)果顯示該位點(diǎn)在白絨山羊群體中沒(méi)有多態(tài)性。啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)T-C轉(zhuǎn)換和C-A顛換，二者間距9bp，命名為T(mén)593C-C603A，檢測(cè)了這兩個(gè)位點(diǎn)在白絨山羊中的基因型頻率和基因頻率；統(tǒng)計(jì)顯示，產(chǎn)絨量、單