EB病毒早期基因BARF1和BHRF1啟動子甲基化狀態(tài)與表達(dá)的研究.pdf

1、EB病毒早期基因B舢Ⅻl和BHRFl啟動子甲基化狀態(tài)與表達(dá)的研究中文摘要EB病毒(EpsteinBarrvirus，EBV)屬人類皰疹病毒科Y皰疹病毒亞科成員，是重要的DNA病毒，具有致癌潛能。體內(nèi)主要感染B淋巴細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞，可導(dǎo)致B細(xì)胞源性腫瘤或上皮細(xì)胞源性腫瘤。EBV相關(guān)胃癌(EBVassociatedgastriccarcinoma，EBVaGC)及鼻咽癌組織中病毒基因表現(xiàn)為限制性表達(dá)，可能與表觀遺傳機(jī)制調(diào)控病毒基因啟動子，

2、尤其是其甲基化狀態(tài)來調(diào)控病毒基因的表達(dá)有關(guān)。目的探討EBV早期基因BARFl啟動子Ap和BHRFl啟動子Hp甲基化狀態(tài)及其對轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究BARFl和BHRFl基因在EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。方法選取EBV陽性細(xì)胞系(GT38，B958，GT39，Raji，PZC666—1，0B，SNU719)和EBVaGC作為研究對象，采用5氮雜2’脫氧胞苷(5Aza—CdR)處理EBV陽性細(xì)胞系(GT38，B958，

3、GT39，Raji)，甲基化特異性PCR(MethylationSpecificPCR，MSP)以及亞硫酸氫鹽基因組測序法(Bisulfitegenomicsequencing，BGS)檢測EBVaGC組織以及5mzaCdR處理前后EBV陽性細(xì)胞系中BARFl和BHRFl基因啟動子Ap和Hp甲基化狀態(tài)。同時采用實時熒光定量PCR(RealtimequantitativePCR，qRTPCR)檢測5AzaCdR處理前后BARFl和BHRF

4、l基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果@MSP檢測結(jié)果顯示在EBV陽性細(xì)胞系中BARFl和BHI強(qiáng)1基因啟動子Ap和Hp均存在不同程度的甲基化，在GT38，GT39，PTC6661和Raji細(xì)胞系呈完全甲基化，為M型；而在SNU719，B958和OB細(xì)胞系發(fā)生不完全甲基化，呈MU型。@BGS檢測結(jié)果顯示，MSP產(chǎn)物電泳為M型的EBVIj日性細(xì)胞系3種EBV早期基因啟動子區(qū)幾乎所有CpG位點均發(fā)生甲基化，而MSP產(chǎn)物電泳呈MU型的EBV陽性細(xì)胞系1種

5、EBV早期基因啟動子區(qū)則表現(xiàn)為部分CpG位點的甲基化。@MSP結(jié)果顯示EBVaGCs癌組織中BARFl基因啟動子有31例為M型(31／43，721％)，MU型12例(12／43，279％)；BHRFl基因啟動子有36例呈M型(36／43，837％)，MU型7例(7／43，163％)，表明2種早期基因的啟動子均呈高甲基化狀態(tài)。@MSP和BGS檢測結(jié)果均顯示EBV陽性細(xì)胞系B958，GT38和GT39在5AzaCdR處理后BARFl和BHR

6、Fl基因啟動子甲基化程度降低。⑤去甲基化試劑5AzaCdR處理B958，Raji，GT38和GT39細(xì)胞系可使EBV早期基因基因BARFl和BHRFl的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平升高，其中BARFl基因在B958，Raji，GT38和GT39細(xì)胞系處理后表達(dá)水平分別為處理前的213，650，7353和250倍，BHRFl基因在B958，Raji，GT38和GT39細(xì)胞系處理StudyofmethylationstatusonBARFlandBHRFl

7、genespromoterandexpressioninEpsteinBarrvirusassociatedgastriccarcinomaAbstractEpsteinBarrvirus(EBV)isanimportantDNAvirusoftheTherpesvirusfamilythatisubiquitousinhumanpopulation，whichhascloserelationshipwithmanykindsofhum

8、anmalignanttumorEBVcouldinfecthumanBlymphocytesandstratifiedsquamousepitheliuminvivoandresultsinavarietyoftumorsderivedfromeitherBcelloriginorepithelialoriginTheEBVgeneexpressioninEBVaGCandNPCcellsisrestricted，andthatmig

9、htberelatedtotheepigeneticmechanismsonregulatingvirusgenepromoterusage，inparticularDNAmethylationobjectiveToexplorethemethylationstatusofEBVearlygeneBARF1andBHRF1promotersandtheinfluenceofthemethylationstatusontranscript

10、ionalexpression，andfurthertesearchtherolesofBARF1andBHRF1playedintheoccurrenceofEBVaGCMethodsThemethylationstatusofBARF1andBHRF1promotersinEBVpositivecelllines(GT38，B95—8，GT39，Raji，PTC6661，OB，SNU719)andEBVaGCtissueswered

11、etectedbymethylation—specificPCR(MSP)andbisulfitegenomicsequencing(BGS)ThemethylationstatusofthepromoterswasdetectedbybisulfitegenomicsequencingandBARF1andBHRF1geneexpressionwasdetectedbyrealtimequantitativePCRbeforeanda

12、fterthetreatmentwith5Aza—CdRinGT38，GT39andB95—8celllinesResults①MSPresultsshowedthatBARF1andBHRF1genepromoterswerehypermethylatedindifferentdegreesThemethylationstausofBARF1andBHRF1genepromotersbyMSPwereMtypein5EBVpositi

13、vecelllines(GT38，GT39，PTC666—1andRaji)andMUtypein3EBVpositivecelllines(SNU719，B95—8，andOB)@BGSresultsshowedthatthecelllineswhichMSPresultisM—type(Raji，GT38，GT39)arehi曲lymethylatedandthecelllinewhichMSPresultisMUtype(B95—

14、8)ispartlymethylated@MSPresultsinEBVaGCstissuesshowedthat31cases(31／43，721％)wereMtypeand12cases(12／43，279％)wereMU—typeinBARFl36cases(36／43，837％)wereMtypeand7cases(7／43，163％)wereMUtypeinBHRFl@ThemethylationstatusofBARFlan

15、dBHRFlpromotersinB95—8，GT39，AGSEBVandGT38celllinesweresignificantlyreducedaftertreatedwith5Aza—CdR⑤TheexpressionofBARF1andBHRF1genewasraisedafterthetreatmentof5AzaCdR，demonstratingthatthemethylationstatuscouldinfluenceth