RASSF1A基因在膀胱癌中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及其啟動子甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、本文采用半定量RT-PCR和甲基化特異性PCR(MSP)檢測正常膀胱組織及膀胱癌組織中RASSF1A基因的表達(dá)及其啟動子甲基化的狀態(tài)，探討RASSF1A基因的表達(dá)與膀胱癌生物學(xué)行為問的關(guān)系。5-氮-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine，5-Aza-CdR)是一種特異性甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，通過去甲基化作用可使多種CpG島高甲基化的抑癌基因重新表達(dá)，恢復(fù)抑癌功能。本研究同時(shí)以膀胱癌BIU87細(xì)胞系為研究對象，以不同濃度的

2、5-Aza-CdR作用于BIU87細(xì)胞，觀察5-Aza-CdR對BIU87細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)研究5-Aza-CdR對膀胱癌BIU87細(xì)胞RASSF1A基因表達(dá)的影響，為膀胱癌的治療提供新的探索。 研究材料和方法： 1、臨床資料： 30例冷凍膀胱癌組織標(biāo)本來自中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院泌尿外科2005年1月至2006年8月手術(shù)治療的膀胱癌患者，10例正常膀胱組織標(biāo)本來自同期前列腺增生癥行開放手術(shù)患者。30例患者中男24

3、例，女6例，年齡28～84歲，平均年齡55.6歲。腫瘤組織經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)，均為膀胱移行細(xì)胞癌。膀胱癌臨床分期按照1997年UICC分期標(biāo)準(zhǔn)：T<,a>2例，T<,1>10例，T<,2>14例，T<,3>2例，T<,4>2例。病理分級按照WHO分級標(biāo)準(zhǔn)：G<,1>8例，G<,2>14例，G<,3>8例。BIU87人膀胱癌細(xì)胞系購自北京大學(xué)泌尿外科研究所。 2、實(shí)驗(yàn)方法： (1)RASsFlAmRNA表達(dá)的檢測提取30例膀

4、胱癌組織及10例正常膀胱組織總RNA，采用半定量RT-PCR檢測膀胱癌組織及正常膀胱組織中RASSF1AmRNA的表達(dá)。 (2)RASSF1A基因異常甲基化狀態(tài)的檢測提取30例膀胱癌組織及10例正常膀胱組織基因組DNA，采用甲基化特異性PCR-(MSP)檢測膀胱癌組織及正常膀胱組織中RASSF1A基因啟動子甲基化狀態(tài)。 (3)5-Aza-CdR誘導(dǎo)膀胱癌BIU87細(xì)胞凋亡的檢測以不同濃度的5-Aza-CdR．作用于膀胱癌

5、BIU87細(xì)胞，AO熒光染色對細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察，MTT法檢測細(xì)胞增殖程度及采用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測5-Aza-CdR對BIU87細(xì)胞凋亡的影響。 (4)5-Aza-CdR．對膀胱癌BIU87細(xì)胞RASSF1A基因表達(dá)的影響以不同濃度的5-Aza-CdR．作用于膀胱癌BIU87細(xì)胞，采用半定量RT-PCR和甲基化特異性：PCR(MSP)檢測5-Aza-CdR對膀胱癌BIU87細(xì)胞RASSF1A基因表達(dá)

6、的影響，同時(shí)應(yīng)用Western blot測定5-Aza-CdR對膀胱癌BIU87細(xì)胞RASSF1A蛋白的表達(dá)的影響。 3、統(tǒng)計(jì)方法： 所有數(shù)據(jù)均用有SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性。 研究結(jié)果： 1、膀胱癌組織中RASSF1 AmRNA表達(dá)10例正常膀胱組織中只11例RASSF1AmRNA表達(dá)缺失，而30例膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本中17例RASSF14AmRNA表達(dá)缺失，膀胱

7、癌組織與正常膀胱組織RASSFlAmRNA表達(dá)率之間差異顯著(P<0.05)。RASSF1AmRNA表達(dá)率在膀胱癌組織病理分級中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在表淺膀胱癌T<,a>-T<,1>(12/12)與侵潤性膀胱癌T<,2>-T<,4>(1/18)中差異顯著(P<0.05)。RASSF1AmRNA表達(dá)水平在膀胱癌病理分級和臨床分期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 2、膀胱癌組織中RASSF1A基因的甲基化狀態(tài)10

8、例正常膀胱組織中只有1例RASSF1A基因甲基化，而30例膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本中21例檢測到甲基化，膀胱癌組織與正常膀胱組織甲基化率之間差異顯著(P<0.05)。RASSF1A基因甲基化發(fā)生率在膀胱癌病理分級中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，但在表淺膀胱癌T<,A>T-<,1>(4/12)與侵潤性膀胱癌T<,2>-T<,4>(17/18)中差異顯著(P<0.05)。 3、5-Aza-CdR誘導(dǎo)膀胱癌BIU87細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果B

9、IU87細(xì)胞經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR處理后，細(xì)胞生長速度受到不同程度抑制，隨著5-Aza-CdR濃度增加抑制作用增強(qiáng)，細(xì)胞的存活率降低，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，處理組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。細(xì)胞凋亡率與5-Aza-CdR濃度水平具有劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。AO熒光染色后5-Aza-CdR處理組可見部分細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)邊集、固縮、斷裂成數(shù)個(gè)黃綠色強(qiáng)熒光顆粒等凋亡的特征性形態(tài)學(xué)改變。 4、5-Aza-CdR對膀胱

10、癌BIU87細(xì)胞RASSF1A基因表達(dá)的影響以GAPDH作為內(nèi)參照，RT-PCR檢測對照組BIU-87細(xì)胞未見RASSF1A基因的mRNA表達(dá)，分別用濃度0.5μmol/L、1.0gmol/L、5.0μmol/L 5-Aza-CdR處理細(xì)胞后，BIU-87細(xì)胞RASSF1AmRNA的相對表達(dá)量分別為：0.73±0.05，1.39±0.03．1.76±0.02，各處理組RASSF1AmRNA的相對表達(dá)量差異有顯著性(P<0.05)。細(xì)胞給

11、予5-Aza-CdR處理后，RASSF1A基因甲基化程度被逆轉(zhuǎn)。經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR處理后，各組細(xì)胞RASSF1A蛋白重新表達(dá)，0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L 5-Aza．CdR處理組RASSFlA蛋白相對表達(dá)量分別為0.49±0.01，0.99±0.05，1.22±0.07，三個(gè)5-Aza-CdR處理組RASSF1A蛋白的相對表達(dá)量差異有顯著性(P<0.05)。 研究結(jié)論：RASSF1A基因