HIV-1 gag基因在人精子基因組中的整合及在早期胚胎細(xì)胞中的復(fù)制與表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-gag，將其轉(zhuǎn)染人精子，與金黃地鼠去透明帶卵母細(xì)胞受精后，檢測HIV-1gag基因在人精子染色體上的整合與在早期胚胎細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)，為HIV-1基因能否在父嬰間垂直傳遞提供直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 方法：⑴pIRES2-EGFP質(zhì)粒；⑵ΔNRF 逆轉(zhuǎn)率病毒質(zhì)粒；⑶人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；⑷精子，取自健康男性自愿者；⑸卵母細(xì)胞，取自成熟雌性金黃地鼠。⑹pIRES2-EGFP-gag質(zhì)粒構(gòu)建，

2、用酶切、PCR 和基因測序3 種方法鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功；⑺細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，檢測pIRES2-EGFP-gag 質(zhì)粒能否在真核細(xì)胞中表達(dá)；⑻人精子與金黃地鼠去透明帶卵母細(xì)胞異種體外受精，獲取受精卵和2-細(xì)胞胚胎；⑼熒光原位雜交（FISH），檢測HIV-1 gag 基因是否在人精子、受精卵雄原核上整合及在胚胎細(xì)胞中復(fù)制；⑽RT-PCR，檢測HIV-1 gag 基因是否在人精子、胚胎細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄；⑾免疫熒光技術(shù)，檢

3、測HIV-1 gag基因是否在人精子、胚胎細(xì)胞中翻譯。
　　 結(jié)果：①質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI分別單酶切及EcoRI 和BamHI雙酶切，PCR和測序證實(shí)pIRES2-EGFP-gag質(zhì)粒構(gòu)建成功；②質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，可見綠色熒光蛋白持續(xù)表達(dá)，表明構(gòu)建的pIRES2-EGFP-gag質(zhì)粒能在真核細(xì)胞中表達(dá)；③人精子與金黃地鼠去透明帶卵母細(xì)胞異種體外受精，成功地獲取了用于實(shí)驗(yàn)的受精卵和2-細(xì)胞胚胎；④F

4、ISH：在人精子頭部、人精子染色體，受精卵雄原核和2-細(xì)胞胚兩個(gè)間期核上均觀察到HIV-1 gag DNA陽性雜交信號(hào)；⑤RT-PCR：在經(jīng)pIRES2-EGFP-gag轉(zhuǎn)染的人精子及其與金黃地鼠去透明帶卵母細(xì)胞受精后所得的胚胎樣本中，觀察到HIV-1 gag基因陽性帶；⑥免疫熒光檢測：在經(jīng)pIRES2-EGFP-gag轉(zhuǎn)染的人精子樣本中未觀察到HIV-1 gag p24蛋白的陽性信號(hào)，但在其與金黃地鼠去透明帶卵母細(xì)胞受精后所得的胚胎樣

5、本中，觀察到HIV-1 gag p24 蛋白的陽性信號(hào)。
　　 結(jié)論：⑴成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-gag；⑵pIRES2-EGFP-gag質(zhì)?？梢栽谡婧思?xì)胞中表達(dá)；⑶HIV-1 gag基因能通過精子膜進(jìn)入精子細(xì)胞并能整合到精子基因組內(nèi)；⑷攜帶HIV-1 gag基因的人精子可以完成正常受精過程；⑸精子介導(dǎo)的HIV-1 gag基因在早期細(xì)胞中與宿主基因組同步復(fù)制并通過卵裂進(jìn)入子細(xì)胞；⑹HIV-1 gag基因可在人精