多個(gè)HIV-1基因的融合及其在BEVS中的表達(dá).pdf

1、自1981年首先發(fā)現(xiàn)艾滋病以來(lái)，HIV病毒已造成了全球性的傳播，成為威脅人類健康的主要因素之一。普遍認(rèn)為研究出安全有效的HIV疫苗是抵抗艾滋病的最佳途徑。目前，HIV疫苗的研制策略包括傳統(tǒng)的減毒、滅活疫苗，以及靠現(xiàn)代基因工程發(fā)展起來(lái)的亞單位疫苗、DNA疫苗和重組載體疫苗等，但仍沒(méi)有哪一種疫苗可有效預(yù)防HIV的感染。亞單位疫苗不含病毒核酸，具有良好的安全性，對(duì)它的研究一直受到人們的關(guān)注。以往的研究表明，基于單一基因而設(shè)計(jì)的亞單位疫苗免疫原

2、性有限，無(wú)法完全中合HIV病毒的感染。將多個(gè)基因融合表達(dá)，得到的重組抗原具有更多的抗原決定簇，有更好的免疫原性。桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)可以容載大片段外源基因，可使多個(gè)基因共表達(dá)，克服了由單一成分所構(gòu)成的亞單位疫苗免疫原性弱的缺點(diǎn)。而且，桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)具有翻譯后修飾功能，表達(dá)產(chǎn)物天然活性好，免疫原性高，因而在疫苗研究中更具有優(yōu)勢(shì)。 本實(shí)驗(yàn)采用PCR方法從HIV-1基因組cDNA質(zhì)粒pNL4-3中克隆到除外膜蛋白基因env外的所

3、有基因片段(包括gag、vpr、pol、vpu，vif、tatl、tat2、nef,revl、rev2)，再用PCR重疊延伸剪接技術(shù)(SOEPCR)將單個(gè)基因片段相互連接，并突變r(jià)ev，以外的全部基因的終止子，得到三個(gè)較大的融合片段，即gag-vpr、pol-vpu-vif-tat-nef，nef-rev。利用片段上的獨(dú)特酶切位點(diǎn)，將三片段依次插入pBacPAK8質(zhì)粒，得到重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK76-04。在重組轉(zhuǎn)移載體中，除env

4、外的所有HIV-1基因融合成為了一個(gè)單一的、大的開放閱讀框。將重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK76-04與線性化的Bm-BacPAK6DNA共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，經(jīng)同源重組，含有目的基因的開放閱讀框插入到多角體啟動(dòng)子下游，從而獲得重組病毒Bm-BacPAK76-04。通過(guò)挑斑以篩選得到純化的重組病毒后，感染家蠶BmN細(xì)胞，分別收集24h、48h、72h、96h和120h的表達(dá)產(chǎn)物，用HIVP24抗體進(jìn)行ELISA分析，結(jié)果表明重組蛋白在細(xì)胞中