HIV-1整合酶的表達(dá)、純化及反應(yīng)特征研究.pdf

1、HIV-1整合酶是由HIV-1病毒pol基因編碼的分子量為32kDa的蛋白質(zhì)，能夠介導(dǎo)病毒DNA與宿主染色體的整合，是病毒復(fù)制周期中必不可少的環(huán)節(jié)，抑制整合酶能夠有效阻止病毒在體內(nèi)復(fù)制。同時(shí)，人體細(xì)胞中無(wú)整合酶的功能類(lèi)似物，因此，整合酶是抗HIV-1的理想靶點(diǎn)。HIV-1整合酶在體內(nèi)通過(guò)催化3’端加工和鏈轉(zhuǎn)移兩步反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)病毒DNA與宿主基因組的整合。整合酶通過(guò)特異性地識(shí)別病毒DNA LTR的CAGT-3’序列，切除末端的GT二核苷，暴

2、露出高度保守的CA-OH3’，病毒cDNA的3’端腺苷酸通過(guò)轉(zhuǎn)脂反應(yīng)以3’-OH同宿主DNA切口的5’端的磷酸基團(tuán)形成新的磷酸二酯鍵，實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合。晶體結(jié)構(gòu)研究顯示：整合酶由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：1、N端結(jié)構(gòu)域：包含鋅指結(jié)構(gòu)，能夠促進(jìn)整合酶的四聚化，影響C端區(qū)與病毒cDNA的結(jié)合；2、核心結(jié)構(gòu)域：是整合酶發(fā)揮功能的關(guān)鍵區(qū)域，三個(gè)高度保守的酸性氨基酸殘基：Asp64，Asp116和Glu152為酶的活性中心，能夠結(jié)合二價(jià)金屬陽(yáng)離子(Mg2+/M

3、n2+)，形成DD3sE型結(jié)構(gòu)：3、C端結(jié)構(gòu)域：其主要功能是非特異性結(jié)合DNA，介導(dǎo)蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的相互作用。因?yàn)橐郧捌毡椴捎玫姆椒ㄊ褂脦в蟹派湫詷?biāo)記的病毒DNA底物，和整合酶共育后，經(jīng)過(guò)變性膠電泳以及放射自顯影，顯示整合酶的反應(yīng)產(chǎn)物。但這種實(shí)驗(yàn)具有耗時(shí)較長(zhǎng)及放射線(xiàn)污染的缺點(diǎn)。為了克服以上缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)分別采用基于磁珠的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法(ELISA)及基于熒光的分子信標(biāo)法鑒定整合酶3’端加工和鏈轉(zhuǎn)移的反應(yīng)活性，并研究其反應(yīng)特性。

4、根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果，設(shè)計(jì)可能為整合酶關(guān)鍵殘基的突變位點(diǎn)，以HIV-1 B亞型國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株pol基因?yàn)槟０蹇寺〕稣厦富?，將其插入pET28a(+)原核表達(dá)載體。通過(guò)重疊PCR方法將第188位賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝彼?K188E)，第189位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸(G189S)，構(gòu)建了HIV-1整合酶突變體pET28a(+)/IN(K188E/G189S)，為后續(xù)研究病毒DNA-整合酶間相互作用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本研究用pET28a(+)IN

5、(F185K/C280S)表達(dá)載體在大腸桿菌中高效表達(dá)HIV-1整合酶；采用親和層析技術(shù)純化HIV-1 IN(F185K/C280S)蛋白質(zhì)；利用基于熒光的分子信標(biāo)法研究病毒DNA-整合酶間相互作用特性。在Eocli BL21(DE3)中進(jìn)行可溶性表達(dá)HIV-1 IN(F185K/C280S)，通過(guò)鎳柱純化，獲得高純度及可溶的整合酶蛋白。采用基于磁珠的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法鑒定整合酶的3’端加工和鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性，利用基于熒光的分子信標(biāo)法對(duì)