HIV-1整合酶全酶結(jié)構(gòu)模擬及其抑制劑篩選.pdf

1、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是引起艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）蔓延的病原體，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、慢病毒屬中的靈長類免疫缺陷病毒亞屬。從1981年美國發(fā)現(xiàn)首例AIDS至今，全世界約有5600萬AIDS患者和HIV感染者，并已造成1390萬人死亡，每天新增感染者1.6萬例。
　　 HIV的復(fù)制周期分為早期階段的吸附、穿入

2、、脫殼、逆轉(zhuǎn)錄、整合及后期階段的病毒基因組復(fù)制、晚期轉(zhuǎn)錄、晚期翻譯、裝配、發(fā)芽成熟等。這些步驟對于病毒感染都是至關(guān)重要的，因而均成為了抗艾滋病病毒的重要靶點。截止至2006年8月，美國FDA批準使用的抗艾滋病藥物共有29種，包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑等共計4大類。盡管這些藥物已成功用于治療艾滋病感染，但由于病毒對此類藥物表現(xiàn)出越來越嚴重的耐藥性，臨床上迫切需要尋找更多作用于不同靶點的抗病毒

3、藥物。
　　 近年來，HIV-1整合酶（integrase，IN）成為一個新穎的靶點而受到人們重視。這是因為與蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶不同，整合酶在哺乳動物體內(nèi)沒有同源蛋白，因此有著更好的選擇性。但相對于蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶抑制劑的開發(fā)較為緩慢。直到2006年，整合酶抑制劑GS-9137進入臨床研究階段，2007年Raltegravir（MK-0518）被批準為第一個抑制整合酶的新藥，才使得在整合酶抑制劑研究上取得了重大突破。

4、>　　 為了進一步開展基于HIV-1整合酶結(jié)構(gòu)的抑制劑設(shè)計，首先必須深入了解HIV-1整合酶的結(jié)構(gòu)和功能。目前蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）中有26個關(guān)于HIV-1整合酶的晶體結(jié)構(gòu)，但僅僅是包含整合酶的單個結(jié)構(gòu)域或其中的兩個結(jié)構(gòu)域，無整合酶全酶的晶體結(jié)構(gòu)。因此，整合酶具體以何種聚合態(tài)發(fā)揮催化作用還不確定，人們對其結(jié)構(gòu)和功能的認識還不夠透徹。
　　 本研究充分利用生物信息數(shù)據(jù)庫和化學(xué)信息數(shù)據(jù)庫中已有的

5、HIV-1整合酶及其抑制劑的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，綜合運用分子模擬技術(shù)和計算機輔助藥物設(shè)計的各種理論和方法，在HIV-1整合酶全酶晶體結(jié)構(gòu)未知情況下，一方面從小分子結(jié)構(gòu)出發(fā)，利用現(xiàn)有抑制劑的結(jié)構(gòu)信息，找出分子中共同的作用模式，即構(gòu)建藥效團；另一方面，從已有的有關(guān)HIV-1整合酶晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)，構(gòu)建HIV-1整合酶全酶及其與病毒DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型，并通過模擬不同作用機制的抑制劑在整合酶中的對接口袋，研究不同類型抑制劑與整合酶的結(jié)合模式和作用方式，進

6、一步為基于結(jié)構(gòu)的抗HIV-1整合酶的藥物設(shè)計提供重要參考。同時開展基于藥效團模型和分子對接的數(shù)據(jù)庫篩選，以及實驗研究。設(shè)計篩選新的HIV-1整合酶抑制劑，對發(fā)展治療艾滋病的聯(lián)合療法具有十分重要的意義。
　　 目的：構(gòu)建出HIV-1整合酶全酶的結(jié)構(gòu)、進一步明確HIV-1整合酶的催化機理及相應(yīng)的催化位點，并在此基礎(chǔ)之上篩選出結(jié)構(gòu)新穎的HIV-1整合酶抑制劑。
　　 方法：利用結(jié)構(gòu)比對、同源模建的方法構(gòu)建全長HIV-1整合酶二

7、聚體結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)之上模擬出相應(yīng)的四聚體模型，與已知的實驗結(jié)果相互驗證，進一步確定整合酶發(fā)揮催化作用時的聚合態(tài)；利用大分子對接、分子動力學(xué)模擬的方法構(gòu)建整合酶-病毒DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，從而確定整合酶的活性部位以及與活性相關(guān)的重要殘基；選取有代表性的整合酶抑制劑構(gòu)建藥效團模型；利用現(xiàn)有的HIV-1整合酶核心結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)建抑制劑分子的對接口袋；基于上述構(gòu)建的藥效團模型及分子對接口袋對中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMD）進行虛擬篩選，尋找符合要

8、求的化合物；通過分子動力學(xué)模擬的方法動態(tài)考察篩選出的化合物與整合酶的結(jié)合情況；在體外檢測化合物的抗HIV-1活性。
　　 結(jié)果：構(gòu)建了HIV-1整合酶四聚體的結(jié)構(gòu)模型以及整合酶二聚體-病毒：DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型；計算得到“鏈轉(zhuǎn)移”抑制劑的一個4點藥效團模型，該模型包括3個氫鍵接受原子（Accept atom）和一個疏水中心（Hydrophobic）；模擬了HIV-1整合酶核心結(jié)構(gòu)域中“鏈轉(zhuǎn)移”抑制劑的對接口袋模型；基于所建的4

9、點藥效團模型和分子對接口袋模型篩選中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMD），得到9個與模型匹配的化合物，分別為蕓薹葡糖硫苷（glucobrassicin）、桂竹香苷（glucocheirolin）、葡萄糖糖芥苷（glucoerysolin）、屈曲花苷（glucoiberin）、蘿卜硫苷（glucoraphanin）、旱金蓮硫糖苷（glucotropaeolin）、黑芥子苷（sinigrin）、新蕓薹苷（neoglucobrassicin）、白芥子苷（

10、sinalbin），該類化合物均屬于硫苷類化合物，具有相似的結(jié)構(gòu)；分子動力學(xué)模擬結(jié)果也顯示該類化合物能較好地與HIV-1整合酶核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
　　 結(jié)論：
　　 1.文獻顯示HIV-1整合酶有兩種可能的聚合形態(tài)，分別為二聚體和四聚體。本研究所構(gòu)建的HIV-1整合酶四聚體結(jié)構(gòu)表明，HTV-1整合酶以四聚體的形態(tài)發(fā)揮催化作用更合理。
　　 2.HIV-1整合酶核心結(jié)構(gòu)域應(yīng)該有2個Mg2+的存在，即整合酶是通過雙金屬

11、離子的作用機理發(fā)揮催化效應(yīng)。
　　 3整合過程中重要的兩個過程“3'-加工”（與病毒DNA的作用位點）和“鏈轉(zhuǎn)移”（與人體DNA的作用位點）在整合酶上占據(jù)不同的催化部位，但彼此位置相近。其中“3'-加工”的催化位點與晶體結(jié)構(gòu)1QS4中小分子抑制劑占據(jù)的位點基本一致。
　　 4.對接結(jié)果顯示，“鏈轉(zhuǎn)移”抑制劑發(fā)揮催化作用的機理可能與螯合整合酶上重要的輔助因子Mg2+有關(guān)。
　　 5.所構(gòu)建的4點藥效團模型（包括三個