HIV-1核心抗原p24基因的表達、純化、鑒定及應用性研究.pdf

1、研究背景及目的:艾滋病是目前人類面臨的最嚴重的疾病之一。據(jù)2011年統(tǒng)計，全球艾滋病毒感染者仍有3400萬人，其中新增感染者為250萬，另有170萬人死于與艾滋病有關的疾病。此外，還有680萬感染者無法及時得到醫(yī)治，所以艾滋病防治形勢依然嚴峻。由于HIV本身的反復突變，對HIV疫苗的研制至今也尚未成功。因此，目前能與之抗爭的最有效的手段仍以預防為主，能否對HIV感染做出快速準確的診斷是阻止其流行擴散的關鍵，因為對每位HIV感染者血清狀況

2、的了解有助于防止感染的再次傳播。
　　 HIV編碼結構蛋白的基因包括Gag、Pol、Env。gag基因產生55kDa蛋白p55。p55由病毒編碼的一個蛋白酶切成四個小蛋白:MA(p17基質)、CA(p24衣殼)、NC(p9核衣殼)及p6。p24是HIV病毒顆粒的主要結構蛋白，在病毒的包裝和成熟過程中發(fā)揮重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之間高度保守，缺失p24的病毒無法正常組裝。HIV感染人體后，感染者血液中首先出現(xiàn)

3、的病毒標志物為病毒p24蛋白。由于從病毒感染到檢出抗HIV抗體之間存在較長的窗口期，因此，HIV-1 p24抗原檢測在HIV感染的早期診斷、預后判斷、抗HIV藥物篩選及判斷母嬰傳播等方面具有重要意義。
　　 目前，對HIV感染的檢測方法包括抗體檢測、p24抗原檢測、核酸檢測以及CD4+T淋巴細胞水平檢測等。由于從感染HIV到出現(xiàn)可檢測的抗體尚有一段時間，因此雖然抗-HIV抗體檢測的ELISA試劑經(jīng)歷了4代發(fā)展，但其“窗口期”問題

4、仍不可避免，而可以進一步縮短“窗口期”的核酸檢測和CD4+T淋巴細胞水平檢測，由于檢測過程較復雜、耗時較長且需要特殊儀器而不易普及。
　　 HIV感染機體后的1～2周，血液中首先出現(xiàn)的病毒標志物為核心蛋白p24，病毒感染1～2個月內才能產生特異性抗體，所以僅是檢測抗HIV抗體存在較長的檢測窗口期。國外已經(jīng)成功研制了HIV抗原和抗體聯(lián)合測定的酶免試劑盒并用于HIV感染的檢測。p24抗原的測定主要用于HIV感染的早期檢測，可縮短感染

5、HIV病毒到檢出的窗口期至12～15d，在現(xiàn)有的HIV抗體測試劑中加入p24抗原的檢測功能，用于獻血員的檢測和流行病學調查，可有效地避免窗口期的漏檢，減少HIV傳播的可能。
　　 HIV侵入機體后，核心抗原p24的水平隨著病毒RNA水平的發(fā)展而發(fā)展，并在急性感染期即可出現(xiàn)，通常被認為是病毒復制的間接標志，與病情發(fā)展密切相關。因此，血液及其它體液標本中p24抗原的檢測可以縮短窗口期，有助于HIV的早期診斷、預后判斷及評價抗病毒治療

6、的效果，具有良好的實際應用價值。
　　 時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）是一種靈敏的高端定量免疫檢測技術，是以鑭系稀土離子作為標記物來標記抗原或抗體，因鑭系稀土離子具有獨特的熒光特性，該技術能夠獲得極高的信噪比，從而具有很高的靈敏度，且還具有標記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用范圍十分廣泛等優(yōu)點。時間分辨熒光免疫分析相對于酶免分析、放射免疫分析有更高的臨

7、床應用價值。該技術適用于各種抗原抗體的臨床檢測，在市場上已得到廣泛應用。有必要再開發(fā)出高靈敏度的HIV抗原的時間分辨熒光免疫分析檢測技術，應用于臨床檢測，完善產品群。
　　 方法:
　　 1.p24表達工程菌的構建及鑒定:利用PCR技術擴增了p24基因，并進行核酸電泳鑒定大小。擴增出的目的基因片段測序并與GenBank中序列進行比對，然后將編碼基因克隆到pET-28a(+)原核表達質粒中，經(jīng)PCR、限制性酶切分析等鑒定后

8、轉化B121(DE3)大腸桿菌，構建p24-pET28a(+)/BL21原核表達工程菌。
　　 2.重組蛋白的誘導表達、純化及鑒定:經(jīng)IPTG誘導后，HIV-1 p24基因在大腸桿菌E.coli DE3中表達His-tag融合重組蛋白。超聲破菌后用親和層析法純化重組蛋白，透析、復性得到有活性的目的蛋白。用陽性病人血清對表達產物進行Western-blot分析和間接ELISA分析，鑒定所表達的p24抗原的活性與抗原性。
　　

9、 3.用雙抗體夾心法研制人免疫缺陷病毒抗原時間分辨熒光免疫分析試劑
　　 3.1以正常人血清作為陰性對照，以正常人血清稀釋p24抗原作為陽性對照。
　　 3.2包被用的HIV p24單抗和標記用的二抗均購自杭州啟泰生物技術有限公司，對照用的HIV p24抗原購自深圳菲鵬生物股份有限公司。
　　 3.3 Eu3+標記抗體的制備。
　　 3.4采用棋盤滴定法對最佳包被量及標記抗體最佳稀釋度進行確定。

10、　　 3.5參考值范圍:以自制的p24-TRFIA試劑檢測80份健康人血清，統(tǒng)計血清p24抗原水平的分布情況，計算樣本熒光值與陰性對照的比值。取比值的平均值，以比值均值加兩個標準差，初步確定為正常人參考值，再綜合其他文獻研究資料及臨床現(xiàn)行參考值范圍，最終確定參考值范圍。
　　 3.6性能評價
　　 3.6.1劑量反應曲線和精密性;
　　 3.6.2特異性分析;
　　 3.6.3抗干擾性分析;
　　

11、 3.6.4穩(wěn)定性;
　　 3.6.5臨床血樣的測試結果
　　 1.HIV-1 p24-pET28a(+)原核表達載體的構建利用PCR技術成功擴增了p24基因。核苷酸序列測定顯示，其大小為693bp，與GenBank中序列進行比對，結果顯示該DNA片段的核苷酸序列與已報道的p24基因序列一致，無移碼突變。并且成功的將p24基因克隆到pET28a(+)原核表達質粒，經(jīng)PCR、限制性酶切和測序等鑒定，證實成功構建了p24-

12、pET28a(+)重組原核表達質粒。
　　 2.p24抗原的表達、純化及鑒定經(jīng)IPTG誘導重組質粒p24-pET28a(+)在大腸桿菌BL21中表達出p24的融合蛋白，分子量約為26kDa，與理論值基本符合，表達產物主要以包涵體的形式存在。重組蛋白經(jīng)過包涵體洗滌，Ni親和層析純化后，純度均達80％以上。用HIV陽性血清對表達產物進行Western-blot分析，顯示在26kDa處出現(xiàn)特異性反應條帶，間接ELISA亦顯示，該p24

13、抗原與陽性血清發(fā)生特異性反應。表明該重組蛋白具有較好的免疫反應性。
　　 3.雙抗體夾心法研制人免疫缺陷病毒抗原時間分辨熒光免疫分析試劑
　　 3.1.綜合考慮本底信號值、信噪比等因素，選擇2μg/mL作為最佳包被抗體濃度，1∶200作為標記抗體的最佳稀釋度。
　　 3.2.參考值范圍:80份查體者血清，檢測熒光值與陰性對照比值平均值(X)為1.3422，標準差(SD)為0.67，均值加2個標準差等于2.68，而

14、當檢測熒光值與陰性對照比值在2.1以下時，包含了99.0％的樣本。據(jù)此設定本方法檢測時的陽性判定標準為:cutoff值=陰性對照熒光值×2.1。
　　 3.3.性能評價的結果顯示
　　 3.3.1HIV p24抗原時間分辨熒光免疫分析法在檢測時不受甘油三酯（體積比5％）、膽紅素(0.32mg/mL)、血紅蛋白(180mg/mL)的干擾，無假陽性、假陰性出現(xiàn)，特異性符合臨床診斷的要求。
　　 3.3.2自制反應模式

15、檢測乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體抗體的陽性樣本，結果均為HIV抗原陰性，說明自制反應體系檢測血樣時不受這些因素的干擾。
　　 3.3.3該反應體系放置于37℃7天，各項性能指標均符合要求，穩(wěn)定性較好。
　　 3.3.4該方法測試的24份抗體陽性的血清中有6份p24抗原陽性結論以上結果表明，本研究成功地構建了p24-pET28a(+)原核重組表達系統(tǒng)，并在大腸桿菌BL21中大量表達與目標蛋白的大小一致融合蛋白，分

16、子量約26kDa。經(jīng)過Wester Blot和間接ELISA鑒定表明，本實驗表達的p24抗原能被HIV陽性病人血清特異性識別。因此，本研究表達的p24抗原具有較強免疫活性。
　　 HIV p24抗原的雙抗體夾心時間分辨熒光免疫分析法的各項指標（靈敏度、精密性、特異性、穩(wěn)定性等）均能夠滿足臨床檢測試劑要求，臨床考核合格，但是受HIV的血樣收集的限制，血樣不是很多，待收集到更多的血樣，在本方法中進行檢測，并與國家食品與藥品監(jiān)督管理局