HIV-1整合酶活性檢測方法建立和應(yīng)用研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的獲得性免疫缺陷綜合癥（艾滋?。┦侨祟悮v史上最嚴(yán)重、最致命的疾病之一。艾滋病目前仍然不能治愈。HIV編碼的整合酶(IN)介導(dǎo)病毒DNA與宿主細(xì)胞基因組整合，是病毒復(fù)制所必需的關(guān)鍵酶之一。抑制IN的功能能夠有效阻斷病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。同時(shí)，由于正常人體細(xì)胞中沒有IN的功能類似物，特異性作用于IN的抑制劑對人體的副作用可能很小。因此，IN被認(rèn)為是抗HIV藥物研發(fā)的理想靶點(diǎn)。
　　 IN在體內(nèi)主要通過

2、催化3＇加工和鏈轉(zhuǎn)移兩步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)整合過程。以上兩步反應(yīng)能夠在體外使用重組IN蛋白、寡核苷酸DNA底物以及二價(jià)金屬輔助離子實(shí)現(xiàn)。此外，IN還能在體外催化鏈轉(zhuǎn)移的逆反應(yīng)——去整合，將鏈轉(zhuǎn)移形成的DNA產(chǎn)物重新還原生成病毒DNA和靶DNA。建立高效的IN活性檢測方法，并據(jù)此開展抑制劑的篩選，是當(dāng)前IN抑制劑體外篩選的主要手段，也是以IN為靶點(diǎn)的抗病毒藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。本研究表達(dá)純化了重組IN蛋白，建立了IN活性檢測的一系列高通量方法，并應(yīng)用

3、這些方法進(jìn)行了IN的性質(zhì)、抑制劑篩選等方面的研究。論文內(nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：
　　 (1)整合酶蛋白表達(dá)純化及3＇加工活性高通量檢測方法的建立
　　 使用PCR獲取了HXB2CG病毒株IN基因，通過序列分析，設(shè)計(jì)突變引物，使用重疊PCR方法將HXB2CG IN基因突變?yōu)镠IV NL4-3 IN基因，并引入了F185K/C280S突變以提高蛋白溶解性。將目的基因連接到pET表達(dá)載體中，在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)了高效且可

4、溶性表達(dá)。通過親和層析方法，從細(xì)胞破碎上清液中純化到純度高且具有3＇加工和鏈轉(zhuǎn)移功能活性的重組IN蛋白。
　　 根據(jù)分子信標(biāo)的原理，設(shè)計(jì)了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)記的模擬病毒DNA序列的3＇加工DNA底物，提出了一種檢測3＇加工反應(yīng)活性的新型熒光分析法。實(shí)驗(yàn)表明，該方法不但靈敏度、特異性高，操作簡單，方便快捷，為全液相反應(yīng)環(huán)境，而且能夠?qū)崟r(shí)定量監(jiān)測IN3＇加工反應(yīng)。該方法能夠用于IN3＇加工反應(yīng)性質(zhì)研究和以3＇加工為靶標(biāo)的IN抑制劑

5、高通量篩選。本研究建立的3＇加工反應(yīng)熒光檢測方法有潛力應(yīng)用到其他蛋白質(zhì)與DNA相互作用的研究中，具有重要的學(xué)術(shù)和應(yīng)用價(jià)值。
　　 (2)整合酶鏈轉(zhuǎn)移活性高通量檢測方法的建立和應(yīng)用
　　 抑制鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)被認(rèn)為是體內(nèi)抑制IN功能活性的關(guān)鍵，當(dāng)前IN抑制劑的體外篩選主要以鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)為靶標(biāo)。本研究設(shè)計(jì)合成了分別用生物素和地高辛修飾的供體DNA和靶DNA，引入了鏈霉親和素磁珠捕獲反應(yīng)DNA產(chǎn)物，提出了檢測IN鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性或者檢測

6、3＇加工與鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)整體活性的高通量酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。
　　 與之前的各種方法相比，我們提出的高通量ELISA具有明顯的改進(jìn)：(ⅰ)無需使用放射性底物，實(shí)現(xiàn)了高通量；(ⅱ)反應(yīng)時(shí)所有的試劑均自由懸浮在液體環(huán)境中，磁珠-DNA產(chǎn)物、磁珠-抗體接觸更容易更充分，顯著提高靈敏度，還能靈活應(yīng)用到研究反應(yīng)中各試劑的相互作用，有助于研究抑制劑的作用機(jī)理；(ⅲ)無需包被、封閉微孔板，省時(shí)省力，檢測前轉(zhuǎn)移磁珠至新的微孔板能夠幾乎

7、完全消除微孔板對試劑的非特異性吸附，有效降低了背景值，提高了特異性；(ⅳ)ELISA和熒光免疫吸附測定(FLISA)兩種檢測策略并用，增加了方法的應(yīng)用范圍。
　　 成功應(yīng)用高通量ELISA研究了金屬離子對鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)的影響，得出了一些有意義的結(jié)果。使用已知IN抑制劑證明了高通量ELISA應(yīng)用到IN抑制劑篩選中的有效性，且從天然產(chǎn)物提取物和合成化合物中成功篩選了數(shù)個(gè)具有初步活性的IN抑制劑。
　　 (3)整合酶去整合活性高通

8、量檢測方法的建立
　　 IN在體外能通過去整合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對整合過程的逆轉(zhuǎn)，且整合酶核心區(qū)(IN-CCD)具有獨(dú)立催化去整合功能。建立去整合活性高通量檢測方法對研究IN功能及篩選IN抑制劑都具有重要意義。本研究表達(dá)純化了具有功能活性的野生型IN及IN-CCD蛋白，設(shè)計(jì)合成了生物素和地高辛雙標(biāo)記的去整合DNA底物，基于鏈霉親和素磁珠捕獲生物素標(biāo)記DNA，建立了一種檢測IN和IN-CCD體外去整合活性的高通量ELISA。
　　

9、研究了金屬離子對去整合高通量ELISA的影響，結(jié)果表明與3＇加工和鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)相似，IN去整合反應(yīng)也更偏好于使用Mn2+而不是Mg2+為金屬輔助離子。進(jìn)一步使用NaCl滴定實(shí)驗(yàn)分析表明，IN去整合對Mn2+的選擇偏好性與Mn2+比Mg2+更能穩(wěn)定IN-DNA復(fù)合物有關(guān)。使用了已知IN抑制劑baicalein驗(yàn)證去整合高通量ELISA篩選IN抑制劑的有效性，證明了baicalein是明確的以IN-CCD為靶標(biāo)的IN抑制劑。本研究建立的去整合

10、高通量ELISA具有高通量、高靈敏度、高特異性、低背景、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，能夠應(yīng)用到去整合反應(yīng)、抑制劑作用機(jī)理等研究中，且具有應(yīng)用到以IN為靶標(biāo)，特別是以IN-CCD為靶標(biāo)的抑制劑高通量篩選的潛力。
　　 野生型(wT)IN和IN-CCD溶解性較差，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)容易形成包涵體，給后期純化及蛋白質(zhì)功能研究帶來不便，而F185K突變后IN和IN-CCD能實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)且活性不受影響。通過構(gòu)建、表達(dá)、純化得到WT和F185K突變型

11、IN-CCD，比較了其溶解性和活性差別。分析并比較了WT和F185K/C280S突變型IN蛋白溶解性和活性差別。結(jié)果表明，F(xiàn)185K和F185K/C280S突變后IN和IN-CCD的溶解性顯著提高，能夠?qū)崿F(xiàn)可溶性表達(dá)；同時(shí)，突變后IN-CCD的去整合活性有一定程度的降低，IN的3＇加工和鏈轉(zhuǎn)移活性有一定程度降低。
　　 進(jìn)一步通過同源模建，構(gòu)建了WT和F185K突變型IN-CCD的蛋白結(jié)構(gòu)，并在水溶液中進(jìn)行了1800ps的分子動

12、力學(xué)(MD)模擬，得出了一些有意義的結(jié)果：(ⅰ)F185K突變后，體系的功能loop區(qū)柔性有一定程度的降低，整體運(yùn)動性略有減小，催化核心DDE基序殘基之間距離無顯著變化，因此，突變后蛋白催化活性降低，但活性受影響程度不大；(ⅱ)F185K突變對IN-CCD內(nèi)部靜電相互作用網(wǎng)絡(luò)的改變驅(qū)動了蛋白構(gòu)象的變化，特別是loop區(qū)構(gòu)象變化明顯，引起蛋白表面的部分疏水殘基被包埋，親水殘基暴露，造成IN-CCD相對的極性溶劑可接近面積增大。同時(shí)，F(xiàn)18