HIV-1整合酶單克隆抗體的制備及整合酶與Importin7相互作用的探討.pdf

1、人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type Ⅰ，HIV-1)的pol基因編碼的三種酶：逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)，蛋白酶(protease，PR)和整合酶(integrase，IN)。的主要功能是將病毒cDNA整合到宿主細(xì)胞的基因組DNA中，另外它亦在病毒RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄及整合前復(fù)合物的進(jìn)核轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起作用。在對(duì)艾滋病(acquired immune de

2、ficiency syndrome，AIDS)的治療過程中，由于傳統(tǒng)抗RT及抗PR等藥物的高毒性，易引起代謝紊亂以及抗藥病毒株的出現(xiàn)，漸漸顯示出它們的局限性。因此，IN及其與宿主細(xì)胞因素間相互作用成為AIDS治療研究的新熱點(diǎn)。在對(duì)HIV-1C端功能的研究中發(fā)現(xiàn)，它可以與DNA非特異性結(jié)合，與宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)因子importin7相互作用，在病毒RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄、整合等HIV-1復(fù)制中的多個(gè)階段起作用。目前對(duì)IN的研究多采用“突變分析”的方

3、法，但此方法可能會(huì)改變IN的構(gòu)象。通過“單克隆抗體”的方法來研究IN，可以在不改變IN的前提下，通過其與IN相瓦作用來反映IN的結(jié)構(gòu)與功能，所以具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IN與importin7的特異性作用位點(diǎn)位于IN的CTD，但是未見關(guān)于importin7與IN作用位點(diǎn)的研究報(bào)道?；诖?，本研究第一部分應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了抗IN第142-288位氨基酸蛋白的單克隆抗體；第二部分應(yīng)用細(xì)胞基礎(chǔ)上共免疫沉淀的方法探討了IN與impo

4、rtin7片段蛋白間的相互作用。本研究旨在為HIV-1IN的結(jié)構(gòu)、功能及開發(fā)抗。HIV-1IN的藥物或疫苗打下基礎(chǔ)。 本研究第一部分，構(gòu)建了HIV-1IN第142-288位氨基酸的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1-GST-INl42-288，在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)后純化了融合蛋白GST-IN142-288。純化了兩種用于篩選雜交瘤克隆的野生型I

5、N融合蛋白：His-IN與T7-IN。以GST-IN142-288作為抗原免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了表達(dá)單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的雜交瘤克隆。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno-sorbent Assay，ELISA)，Western-blot(WB)，免疫沉淀(Immuno-precipitation，IP)及免疫熒光染色的方法對(duì)mAbs進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示

6、，共制備了45個(gè)ELISA陽性的雜交瘤克隆，其中有12個(gè)克隆WB與IP陽性，3個(gè)克隆免疫熒光染色陽性。對(duì)12個(gè)WB與IP陽性的克隆分泌的mAb進(jìn)行亞型測(cè)定，結(jié)果顯示重鏈亞型中3個(gè)為IgGl，6個(gè)為IgG2a，2個(gè)為IgG2b，1個(gè)為IgM；所有的輕鏈亞型均為κ。本研究的第二部分探討IN與importin7的相互作用。構(gòu)建了表達(dá)importin7第207-836位氨基酸及第442-836位氨基酸融合蛋白的質(zhì)粒sVCMVin-T7-Imp7

7、207-836和sVCMVin-T7-Imp7 442-836。將上述兩個(gè)質(zhì)粒分別與表達(dá)野生型HIV-1IN的質(zhì)粒CMV-YFP-IN共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，采用細(xì)胞基礎(chǔ)上共免疫沉淀(cell-based co-IP)的方法對(duì)兩種importin7融合蛋白與YFP-IN融合蛋白間的相互作用進(jìn)行研究。結(jié)果顯示T7-importin7207-836與T7-imp7442-836均能與YFP-IN相互作用。提示IN與importin7相瓦