α-烯醇化酶單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性的初步鑒定.pdf

1、烯醇化酶是一種普遍存在的細(xì)胞質(zhì)糖酵解酶，它在糖酵解過(guò)程中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與2-磷酸甘油酸(PGA)之間的轉(zhuǎn)化。最近的研究表明，烯醇化酶不僅僅只在糖酵解與糖異生過(guò)程中發(fā)揮酶的催化作用，它還是一種具有多種不同功能的蛋白質(zhì)。烯醇化酶可作為自身抗原，誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病;也可作為c-myc啟動(dòng)子結(jié)合蛋白負(fù)向調(diào)控c-myc表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化過(guò)程;可作為纖維蛋白溶酶原受體參與纖溶過(guò)程，還可作為特異性標(biāo)志物用

2、于肺癌的診斷等。在各種傳染病及自身免疫病中被檢測(cè)到烯醇化酶抗體，這些抗體在病理生理?xiàng)l件下可能促使了某些特定器官的微生物感染及細(xì)胞不可控的增長(zhǎng)繁殖。本文旨在研究烯醇化酶單克隆抗體對(duì)于烯醇化酶的特異性作用及其抗原表位的預(yù)測(cè)分析，從而探討烯醇化酶抗體在人體病理生理活性研究中的潛在價(jià)值。
　　本文通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建人α-烯醇化酶基因的重組表達(dá)載體，并將成功表達(dá)的人α-烯醇化酶純化后作為抗原免疫小鼠，用以制備烯醇化酶單克隆抗體。經(jīng)過(guò)細(xì)胞融

3、合，有限稀釋，陽(yáng)性克隆檢測(cè)以及克隆化培養(yǎng)后，成功篩選出一株單克隆抗體6B2，同時(shí)應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和免疫組化技術(shù)對(duì)此抗體加以驗(yàn)證。噬菌體隨機(jī)十二肽展示技術(shù)篩選6B2單克隆抗體的抗原表位，并應(yīng)用Ellipro、 PyMOL等生物學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)其抗原表位。研究結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)PCR擴(kuò)增得到人α-烯醇化酶目的基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-eno，經(jīng)過(guò)單雙酶切驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過(guò)SDS-PAG

4、E分析，在37℃，0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h條件下，烯醇化酶的表達(dá)量最大。超聲破碎，所得上清及沉淀經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析，烯醇化酶在細(xì)胞上清液中有很高的可溶性表達(dá)。
　　2.將入α-烯醇化酶與本實(shí)驗(yàn)室之前制備大腸桿菌烯醇化酶作為抗原免疫小鼠，四次免疫后血清效價(jià)稀釋一百倍時(shí)OD值達(dá)到1.5，可用于細(xì)胞融合。通過(guò)細(xì)胞融合成功制備一株抗入α-烯醇化酶單克隆抗體命名為6B2，生物學(xué)特性檢測(cè)顯示屬于IgG1亞型，能夠與人α-烯醇化酶

5、和大腸桿菌烯醇化酶發(fā)生特異性反應(yīng)，與人α-烯醇化酶的特異性反應(yīng)強(qiáng)于大腸桿菌烯醇化酶。
　　3.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、免疫組化技術(shù)驗(yàn)證單克隆抗體6B2與組織細(xì)胞內(nèi)的α-烯醇化酶的反應(yīng)。由于烯醇化酶在進(jìn)化上高度保守，所以取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞做細(xì)胞爬片，人α-烯醇化酶抗體6B2作為一抗，驗(yàn)證單克隆抗體與組織細(xì)胞內(nèi)的烯醇化酶的結(jié)合情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此單抗6B2能結(jié)合巨噬細(xì)胞的烯醇化酶。
　　4.應(yīng)用噬菌體隨機(jī)十二肽展示庫(kù)篩選6B2單克隆

6、抗體的抗原表位，經(jīng)過(guò)三輪的擴(kuò)增與淘選后，提取特異性結(jié)合的噬菌體DNA，測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果顯示插入的相同序列為CGCACTGCCCAGTAGACCTGAGAACTTCAGTTCCAG，相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列DLDFKSPDDPSR，此序列與人α-烯醇化酶的259-262及267-269的氨基酸相同。經(jīng)過(guò)Ellipro、PDB等生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)所測(cè)得的氨基酸序列恰好位于烯醇化酶三維結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)凸環(huán)上，分別為第259-262氨基酸與第26