一種新型結(jié)直腸癌單克隆抗體的制備與生物學(xué)特性鑒定.pdf

1、結(jié)直腸癌是惡性腫瘤中較常見的類型之一，預(yù)后較差，5年生存率小于500％，Ⅳ期患者則不超過10％。在我國，隨著生活方式和飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，已躍居各種惡性腫瘤發(fā)病率的第四位。由于其發(fā)病原因不清，而且，早期癥狀不明顯，初次發(fā)現(xiàn)時已有25％的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，另外的75％患者即便能夠手術(shù)切除，但仍有1/2左右出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，這部分患者的預(yù)后較差，雖然各種抗癌藥物的應(yīng)用在一定程度上取得一些療效，但因抗癌藥物的副作用和腫瘤對藥物

2、產(chǎn)生耐受等，往往難以達(dá)到治療目的。因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療仍是提高結(jié)直腸癌治愈率的基本策略，而尋找有效的早期診斷或治療的特異性標(biāo)志物則是基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)工作者的長期目標(biāo)。 隨著對癌癥發(fā)生分子機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一些與腫瘤發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)的分子，以此為靶點(diǎn)的腫瘤疫苗、單克隆抗體和小分子藥物抑制劑等成為治療腫瘤的新的手段。其中，單克隆抗體倍受人們關(guān)注，因它能夠與腫瘤組織細(xì)胞的抗原成分特異性結(jié)合，介導(dǎo)殺傷腫瘤細(xì)胞，

3、并能避免對正常組織的損害，成為惡性腫瘤診治的有效策略之一。目前，應(yīng)用單克隆抗體結(jié)合藥物利妥西治療淋巴腫瘤取得了較好的效果，但對實(shí)體瘤效果不甚理想，可能與實(shí)體瘤的分子異質(zhì)性，難以找到普遍特異的分子靶點(diǎn)有關(guān)，例如，常用于結(jié)直腸癌的依決洛單抗(edrecolomab，MAb 17-1A)、貝伐單抗(bevacizumab，Abastin)和西妥西單抗(cetuximab，IMC-C225)，雖能提高部分晚期結(jié)直腸癌患者的生存期5-11月，但應(yīng)

4、用范圍和療效均較有限，可見結(jié)直腸癌單克隆抗體的研發(fā)也面臨同樣的問題。因此，制備針對結(jié)直腸癌較特異和敏感的單克隆抗體，用于臨床相關(guān)疾病的診斷和治療將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。 目前針對結(jié)直腸癌的單克隆抗體均是采用腫瘤細(xì)胞系免疫動物，制備的單克隆抗體的特異性普遍不高；為克服這一問題，本研究擬從優(yōu)化抗原和改進(jìn)篩選方法入手，采用新鮮的結(jié)直腸癌患者手術(shù)標(biāo)本，包括高、中、低分化結(jié)直腸癌，直接分離腫瘤細(xì)胞免疫動物；在篩選方法上，避免

5、了傳統(tǒng)的ELISA方法，而采用結(jié)直腸癌組織標(biāo)本的免疫細(xì)胞化學(xué)染色篩選針對腫瘤組織的特異性單克隆抗體，具有一定的直觀性和特異性，可能更接近于患者體內(nèi)腫瘤抗原的真實(shí)表達(dá)情況。 本研究主要結(jié)果如下： (一)細(xì)胞融合及特異性單克隆抗體的獲得 制備結(jié)直腸癌細(xì)胞懸液免疫小鼠，共免疫6只動物，經(jīng)檢測血清針對結(jié)直腸癌的抗體效價明顯升高后，取脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合，三次融合共獲96個細(xì)胞克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

6、表明，與結(jié)直腸癌組織反應(yīng)陽性的克隆為32個。本研究選擇免疫染色特異性強(qiáng)、細(xì)胞克隆生長良好的2個克隆(分別命名為2-3和15-8)進(jìn)行單克隆化、擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)一步鑒定結(jié)果表明2-3單克隆抗體的特異性較15-8的高，故我們主要對2-3單克隆抗體進(jìn)行了較細(xì)致的實(shí)驗(yàn)研究。 (二)2-3 單克隆抗體的組織特異性檢測 收集30例原發(fā)性結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本、20例其它腫瘤標(biāo)本、肺癌細(xì)胞系和結(jié)直腸癌細(xì)胞系以及正常組織(對照用)，采用間接免

7、疫酶細(xì)胞化學(xué)染色法顯示相應(yīng)抗原的分布，同時與已知的市售CEA抗體染色結(jié)果對比分析。 2-3單克隆抗體(培養(yǎng)上清和腹水)，在30例結(jié)直腸癌組織冰凍切片中效價高達(dá)1:150000，陽性率為100％，癌組織的染色強(qiáng)度和陽性比例遠(yuǎn)高于癌旁的黏膜組織(P<0.05)；不同分化程度的結(jié)直腸癌組織，以中、低分化腺癌的抗原表達(dá)量為多，其反應(yīng)陽性物質(zhì)主要存在于腺癌的腺管管腔和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表明該抗體識別的抗原可能主要為癌細(xì)胞分泌的蛋白成分。結(jié)直腸癌標(biāo)

8、本的石蠟切片免疫染色結(jié)果與冰凍切片相似，但染色強(qiáng)度稍弱，而且，抗體效價較冰凍切片低，約為1:100000左右。 在癌旁組織中，可見食管、胃、結(jié)直腸、肝內(nèi)膽小管呈弱陽性反應(yīng)，但陽性率非常低，而且，染色范圍僅局限于上皮表層；其它正常組織，如小腸、膽囊、肺、腦、脾、乳腺、肌肉、結(jié)締組織、紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等，均未見陽性反應(yīng)。 與其它癌組織及結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移標(biāo)本的免疫染色結(jié)果呈不同程度的陽性，其中，食管癌1例陽性(1/2)，

9、胃癌3例陽性(3/3)，肝細(xì)胞癌4例陽性(4/4)，肺癌6例陽性(6/7)，乳腺癌陰性(0/2)，結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移1例陽性(1/1)，結(jié)直腸癌腦轉(zhuǎn)移1例陽性(1/1)。陽性產(chǎn)物主要分布于腺癌的癌細(xì)胞、鱗癌的癌巢中心和印戒細(xì)胞癌，而所有腫瘤組織的間質(zhì)成分均為陰性。 該抗體與肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480均呈陽性反應(yīng)。 與已知的市售CEA抗體染色結(jié)果對比分析表明，2-3單克隆抗體所識別的抗原成分與CEA相似，均在結(jié)

10、直腸癌、肺癌和胃印戒細(xì)胞癌中表達(dá)較多，但2-3單克隆抗體較CEA染色特異性強(qiáng)，效價高(CEA的稀釋度最高為1:8000左右)。 (三)核型檢測、western blot和抗原性質(zhì)分析 本研究所獲得的兩株雜交瘤已連續(xù)培養(yǎng)9個月，至今仍保持良好的抗體分泌能力，凍存復(fù)蘇后亦能分泌大量抗體，腹水產(chǎn)生效果良好，染色體檢查符合雜交瘤細(xì)胞的基本特征。Western blot結(jié)果顯示結(jié)直腸癌提取的蛋白在180KD處與CEA反應(yīng)有一清晰的

11、條帶，而與2-3單克隆抗體反應(yīng)條帶不明顯?？乖?jīng)SDS和β-巰基乙醇混合加熱后，與2-3單克隆抗體點(diǎn)雜交的陽性反應(yīng)消失，與CEA點(diǎn)雜交的陽性反應(yīng)不變，提示2-3單克隆抗體識別的抗原表位可能與CEA識別的抗原構(gòu)象有所不同。 結(jié)直腸癌組織切片經(jīng)1％高碘酸鈉處理后，對2-3單克隆抗體和CEA染色的陽性部位和陽性面積無明顯影響，而經(jīng)0.25％胰酶處理后，與二者的陽性反應(yīng)消失，提示兩種抗體所識別的抗原主要為蛋白類抗原，但有關(guān)2-3單克隆抗