抗人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(humanMesenchymalStemCells，hMSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞群體，是近年來干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。hMSCs是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的理想種子細(xì)胞，在臨床具有廣闊的應(yīng)用前景。 近十年來干細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域的突破，使人們對(duì)hMSCs的生物學(xué)特性有了較深入的認(rèn)識(shí)，但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)其特異表面膜標(biāo)志，現(xiàn)行的分離方法主要是根據(jù)hMSCs的生長(zhǎng)特性、表型特征和所具有

2、的多向分化潛能進(jìn)行評(píng)判，影響因素多，操作繁瑣，費(fèi)用昂貴，所得細(xì)胞均一性尚不理想，且不同實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)的可比性差。因而人們一直在努力尋找特異的hMSCs的標(biāo)記分子。 本研究以分離培養(yǎng)的hMSCs免疫BALB/C小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備抗hMSCs的單克隆抗體，并通過間接免疫熒光、免疫組織化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)等方法對(duì)其生物學(xué)特性作了初步的鑒定，并以制備的單克隆抗體作探針，用于hMSCs的分選及表面特異性膜分子研究。 實(shí)驗(yàn)方法

3、1.hMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定：從正常健康供者獲取骨髓，以Ficoll-paque分離液分離獲取單個(gè)核細(xì)胞層經(jīng)培養(yǎng)后，棄去非貼壁細(xì)胞，以10％胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，所得細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表型。 2.抗hMSCs單克隆抗體的制備：采用多供體(2份以上供者)hMSCs以0.01MpH7.2PBS懸浮免疫BALB/C小鼠，每只0.2ml(1.0×106)腹腔注射，每周1次，共4次，于融合前3天加強(qiáng)免疫一次。取免疫

4、小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在50％PEG(MW4000)作用下融合，用含20％小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。以改良的間接免疫熒光法篩選抗體。選擇陽性克隆進(jìn)行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，直至抗體陽性率達(dá)100％，雜交瘤細(xì)胞接種于經(jīng)液體石蠟處理過的BALB/C小鼠腹腔，兩周左右后收集腹水，以間接免疫熒光測(cè)腹水效價(jià)，又以免疫金層析法測(cè)定單克隆抗體的類別.用鹽析法和DEAE纖維素離子交換純化，SDS-PAGE鑒定純度。 3.抗hM

5、CSs單抗的生物學(xué)特性檢測(cè)：采用間接ELISA測(cè)定5株單抗的親和力，并進(jìn)行表位結(jié)合分析，用間接免疫熒光法檢測(cè)了外周血淋巴細(xì)胞、HL-60、Raji、血管內(nèi)皮細(xì)胞及大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞與單抗的交叉反應(yīng)；又以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了5株單抗在肌肉、骨髓神經(jīng)等12種組織標(biāo)本中的表達(dá)。 4.應(yīng)用：(1)建立免疫磁珠分選hMCSs通過正向免疫磁珠分選骨髓單個(gè)核細(xì)胞，繼而用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其純度及表型特征，并對(duì)篩選后的細(xì)胞作分化能力進(jìn)行研究。(2)單

6、抗的熒光標(biāo)記用FITC直標(biāo)純化后的單抗，用于hMCSs的鑒定。 結(jié)果 1.hMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定：分離所得hMSCs經(jīng)傳代培養(yǎng)，棄去非貼壁細(xì)胞后，得較純hMSCs，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表型為CD29+、CD44+、CD166+、CD34-、CD45-、HLA-DR-。 2.抗hMSCs單克隆抗體的制備：以分離培養(yǎng)的hMSCs免疫BALB/C小鼠，采用雜交瘤技術(shù)將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。在融合的1248孔

7、中，經(jīng)間接免疫熒光法篩選到陽性雜交瘤27孔，上述陽性孔細(xì)胞作適當(dāng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，液氮保存。在27個(gè)陽性雜交瘤孔中取10孔進(jìn)行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，結(jié)果獲得能穩(wěn)定分泌抗hMSCs單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞5株，定名為ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUE12和ZUF10。上述細(xì)胞株經(jīng)3次以上克隆化培養(yǎng)，在體外持續(xù)培養(yǎng)6月余，分泌抗體性能穩(wěn)定，凍存、復(fù)蘇后細(xì)胞生長(zhǎng)良好。5株單抗效價(jià)(腹水)均＞106，單抗的類別除ZUC3為IgMκ外，其余4株均為IgG1

8、κ。 3.特性檢測(cè)：5株單抗的相對(duì)親和力分別為：ZUB1：1×106、ZUB4：1×105、ZUC3：1×106、ZUE12：1×105、ZUF10：1×105。表位分析的結(jié)果提示ZUB1、ZUE12、ZUF10針對(duì)相同的表位，ZUC3及ZUB4則分別針對(duì)不同的表位，用間接免疫熒光法將5株單克隆抗體分別與外周血淋巴細(xì)胞、HL-60、Raji、血管內(nèi)皮細(xì)胞及大鼠MSCs作交叉反應(yīng)，同時(shí)以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了12個(gè)間充質(zhì)和非間充質(zhì)來

9、源的組織標(biāo)本，以hMSCs作陽性對(duì)照，結(jié)果5個(gè)單克隆抗體除ZUC3對(duì)大鼠來源的MSCs有反應(yīng)外，其余均未見交叉反應(yīng) 4.應(yīng)用：通過建立的正向免疫磁珠分選法對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分選，7-10×107人骨髓單個(gè)核細(xì)胞可獲得4-5×105細(xì)胞，此群細(xì)胞CD29、CD44、CD105、CD166陽性，造血細(xì)胞分化抗原則為陰性，并具有向多種細(xì)胞分化的潛能。 結(jié)論 本研究制備了5株特異性針對(duì)hMSCs表面膜分子的單克隆抗體，為尋找