鼠抗人PD-L1單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、Bretscher和Cohn在T細(xì)胞活化雙信號(hào)模型的基礎(chǔ)上提出“協(xié)同刺激信號(hào)”，即T細(xì)胞的活化除了需要通過APC遞呈MHC-抗原肽給抗原特異性T細(xì)胞提供第一信號(hào)外，還需要一系列協(xié)同刺激分子提供第二信號(hào)，才能使T細(xì)胞達(dá)到生理活化閾值產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答。如果缺少共刺激分子提供的第二信號(hào)，將會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的無反應(yīng)性或特異性免疫耐受甚至凋亡。正性和負(fù)性協(xié)同刺激信號(hào)的調(diào)節(jié)及兩者之間的平衡在機(jī)體免疫應(yīng)答的整個(gè)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。 共刺激

2、分子分為TNF／TNFR和B7／CD28兩大超家族。近幾年，B7家族成員不斷擴(kuò)大，其中PD-L1是新近發(fā)現(xiàn)的共刺激分子之一。PD-L1具有IgV和IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)，具有廣泛的組織表達(dá)譜，甚至在一些腫瘤細(xì)胞株上也有較高表達(dá)。PD．1是PD-L1的一個(gè)抑制性受體，主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞上，PD-1／PD-L1途徑在抑制T細(xì)胞增殖的同時(shí)，也影響很多細(xì)胞因子的分泌。同時(shí)，PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的高表達(dá)，能減弱機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用，

3、可能與腫瘤的免疫逃避機(jī)制密切相關(guān)，阻斷此途徑可增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。大量研究顯示PD-L1在機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用，PD-L1可能會(huì)成為腫瘤治療中新的靶分子。更為重要的是，目前關(guān)于PD-L1對(duì)T細(xì)胞的生物學(xué)作用，不同的研究小組報(bào)道了截然不同的結(jié)果，一些研究表明，PD-L1還能作用T細(xì)胞促進(jìn)其顯著增殖和IL-2的分泌，具體機(jī)制尚不明了。 本研究課題首先利用天然高表達(dá)PD-L1的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-23l

4、細(xì)胞為免疫原免疫BALB~小鼠，采用B淋巴細(xì)胞融合技術(shù)，將反復(fù)免疫后的小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0進(jìn)行細(xì)胞融合，以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929／PD-L1作為陽性篩選細(xì)胞，以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞L929／mock作為陰性對(duì)照細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記分析及抗體分泌陽性雜交瘤細(xì)胞的反復(fù)篩選，并經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得l株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為10E10。經(jīng)快速定性試紙法分析鑒定，10E10的重鏈為IgGl

5、；而輕鏈為K，可用于Western-blot和免疫組織化學(xué)分析。雜交瘤細(xì)胞株體外連續(xù)傳代(40代)培養(yǎng)，液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍生長良好，穩(wěn)定分泌抗體。 運(yùn)用成功制備的單抗，我們探討了PD-L1信號(hào)對(duì)人外周血T細(xì)胞和Mo-DC的生物學(xué)行為的影響。單抗10E10能阻斷PD．1一PD-L1通路，通過下調(diào)負(fù)性信號(hào)的作用，在體外刺激T細(xì)胞的增殖，同樣能夠促進(jìn)雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，由此證實(shí)所獲的抗人PD-L1單抗10E10為阻斷型功能抗體。

6、單抗10E10能結(jié)合體外誘導(dǎo)的Mo-DC上表達(dá)的PD-L1分子，并通過逆向信號(hào)抑制DC的成熟，表現(xiàn)為下調(diào)DC表面的正性共刺激分子的表達(dá)以及提高DC的抗原吞噬能力。腫瘤細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)表明，單抗10E10通過阻斷腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1分子與活化T細(xì)胞上相應(yīng)受體之間的相互作用，進(jìn)而抑制活化T細(xì)胞的凋亡，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 單抗10E10和本室已有的一株抗PD-L1單抗2H11識(shí)別不同的抗原位點(diǎn)。以2H1l為包被抗體、Bi

7、o—10ElO為檢測(cè)抗體，成功建立了可溶性PD-L1蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。以此方法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的PD-L1蛋白和商品化PD-L1標(biāo)準(zhǔn)蛋白，所繪制的工作曲線均有良好的線性關(guān)系。 綜上所述，本研究成功制備了一株特異性鼠抗人PD-L1功能型單克隆抗體，并初步探討了PD一1．PD-Ll共信號(hào)對(duì)人外周血T細(xì)胞和Mo-DC的生物學(xué)效應(yīng)，及其在腫瘤免疫逃逸中的作用，證實(shí)了PD-L1信號(hào)在免疫應(yīng)答的不同階段和不同的免疫微環(huán)境中發(fā)揮的不同