人CXCR4轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建與單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、CXCR4(CDl84)分子屬趨化因子家族，人CXCR4基因由由Feng等人于1996年發(fā)現(xiàn)并命名為Fusin,后來(lái)又被稱(chēng)為L(zhǎng)ESTR或HUMSTR，人CXCR4基因位于染色體2q21區(qū)，編碼由352個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是高度保守的7次跨膜受體。CXCR4通過(guò)與其唯一的配體SDF一1Q構(gòu)成SDF．1α／CXCR4反應(yīng)軸而發(fā)揮生物學(xué)功能。CXCR4分子具有廣泛的表達(dá)譜，主要表達(dá)在外周血的CD2610wCD45RA+CD45RO-T淋巴細(xì)

2、胞，B淋巴細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞表面。CXCR4分子在免疫細(xì)胞、造血細(xì)胞的遷移和歸巢中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，而且參予神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、血管發(fā)生、組織損傷修復(fù)和再生等。近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)大多腫瘤細(xì)胞也表達(dá)CXCR4，且腫瘤細(xì)胞表達(dá)CXCR4與其向組織侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨著CXCR4分子的生物學(xué)功能和信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制的進(jìn)一步研究，使其成為一個(gè)理想的生物干預(yù)靶分子，針對(duì)CXCR4分子的阻斷劑將有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。因此，CXCR4

3、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建、CXCR4分子拮抗劑的研制及其在SDF。1Q／CXCR4信號(hào)傳導(dǎo)中的阻斷作用的研究將為腫瘤的治療提供有力的途徑。 1.人CXCR4基因的克隆及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建 本研究通過(guò)RT-PCR方法，從人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的總RNA中擴(kuò)增出編碼人CXCR4全長(zhǎng)的cDNA片段，通過(guò)基因克隆技術(shù)，將其插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term。進(jìn)一步采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組表達(dá)載體與輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293

4、T，用其培養(yǎng)上清感染L929細(xì)胞72h后，經(jīng)Zeocin篩選出穩(wěn)定表達(dá)CXCR4分子的L929細(xì)胞株(L929／CXCR4)。經(jīng)體外長(zhǎng)期傳代和液氮反復(fù)凍存和復(fù)蘇，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長(zhǎng)良好，并穩(wěn)定表達(dá)CXCR4。構(gòu)建的L929／CXCR4轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能在SDF．1Q作用下介導(dǎo)遷移。 2．分泌鼠抗人CXCR4單抗的雜交瘤細(xì)胞株的制備 利用上述構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929／CXCR4為免疫原，免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞融合技術(shù)，

5、將反復(fù)免疫后的小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0進(jìn)行細(xì)胞融合，以此轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為陽(yáng)性篩選細(xì)胞，以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞L929／mock作為陰性對(duì)照細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光標(biāo)記法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，并經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得l株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CXCR4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株32F7。經(jīng)快速定性試紙法分析鑒定，32F7的重鏈為Ig2a；輕鏈為K。經(jīng)體外連續(xù)傳代(40代)培養(yǎng)，液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍生長(zhǎng)良好，穩(wěn)定分泌抗體。細(xì)胞

6、染色體的核型分析表明所得到的細(xì)胞株是一個(gè)雜交瘤細(xì)胞株。 進(jìn)而采用本室建立的腹水誘生和純化方案，腹水形成陽(yáng)性率為95％以上，腹水的產(chǎn)量平均約為5．Omi／只小鼠。經(jīng)ProteinG親和層析柱分離純化，腹水型單抗純化后蛋白含量在2mg／ml左右。純化后單抗的效價(jià)為1：1000以上，抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為1．O~2．0pg／l×106細(xì)胞。 3．鼠抗人CXCR4單克隆抗體的體外生物學(xué)特性研究 以L929／

7、CXCR4為競(jìng)爭(zhēng)靶細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示，32F7與商品化的抗體12G5識(shí)別CXCR4分子的抗原位點(diǎn)完全不同。另外，經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記顯示，32F7能特異性識(shí)別T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞，DC，以及許多腫瘤細(xì)胞表面的CXCR4分子。且免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明32F7可以識(shí)別一些組織表達(dá)的CXCR4分子。經(jīng)過(guò)板孔遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所制備得到的抗人32F7抗體能較好的阻斷SDF-1Q／CXCR4軸在T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞遷移中的作

8、用，由此表明32F7單抗是有阻斷SDF-1Q／CXCR4相互作用的阻斷性單克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)32F7單抗在阻斷SDF-1Q／CXCR4信號(hào)后可阻滯Raii細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)增殖周期，從而抑制了B淋巴瘤細(xì)胞的體外增殖，而且隨著抗體濃度的增加該效果更為明顯。 綜上所述，本研究成功克隆了人CXCR4基因、構(gòu)建了轉(zhuǎn)CXCR4的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并研制了l株能穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CXCR4功能性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為深入探討SDF．1Q／CX