鼠抗人2IgB7-H3功能性單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、B7-H3分子是最新發(fā)現(xiàn)的B7家族的新成員，屬于B7超家族成員，為I型跨膜球蛋白，分子量為45-110kDa，編碼361-534個(gè)氨基酸。該分子具有IgV和IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)及信號(hào)肽區(qū)。B7-H3mRNA有較廣泛的組織表達(dá)譜，在某些惡性腫瘤細(xì)胞上也有較高的表達(dá)，其相應(yīng)的受體尚未發(fā)現(xiàn)，有文獻(xiàn)報(bào)道，B7-H3對(duì)T細(xì)胞存在兩種不同的效應(yīng)：刺激或者抑制效應(yīng)。B7-H3能夠刺激T細(xì)胞的增殖，使CTL的活性增加，特異性提高IFN-γ分泌表達(dá)

2、；但也有研究者發(fā)現(xiàn)，B7-H3能抑制CD4+T細(xì)胞的增殖及IFN-Y分泌表達(dá)。更為重要的是B7-H3有2IgB7-H3和4IgB7-H3兩個(gè)異構(gòu)體，其表達(dá)的差異及生物學(xué)意義尚需深入研究。目前本校醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所已研制了既能識(shí)別4IgB7-H3又能識(shí)別2IgB7-H3的兩株單抗，鑒于此，研究共刺激分子2IgB7-H3的特異性單抗更加有助于該共刺激信號(hào)學(xué)功能的研究，并且在腫瘤免疫及自身免疫性疾病的治療中均具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究成功研制

3、了一株新的鼠抗人2IgB7-H3功能性單克隆抗體7D7，并對(duì)其生物學(xué)特性及生物學(xué)功能做了初步的鑒定。通過對(duì)比2IgB7-H3單克隆抗體和4IgB7-H3單克隆抗體的生物學(xué)特性及其功能，將為理解B7-H3分子在信號(hào)調(diào)節(jié)途徑、免疫應(yīng)答提供新的研究視角，具有一定的應(yīng)用前景。 研究目的：制備鼠抗人2IgB7-H3分子的單克隆抗體(mAb)并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)特性的鑒定；利用自主研制的抗人2IgB7-H3mAb，研究B7-H3在DCs上的

4、表達(dá)及其信號(hào)途徑在DCs上的生物學(xué)作用，同時(shí)鑒定2IgB7-H3和4IgB7-H3單克隆抗體的腫瘤細(xì)胞表達(dá)譜的生物學(xué)差異和單抗7D7在腫瘤免疫中的生物學(xué)作用。 實(shí)驗(yàn)方法：(1)以高表達(dá)2IgB7-H3的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929／2IgB7-H3作為免疫原免疫Balb／C小鼠；(2)采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0融合；(3)L929／2IgB7-H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為目的單抗的篩選細(xì)胞，通過間接免疫

5、熒光標(biāo)法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選；(4)單抗標(biāo)記生物素，通過競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)檢測(cè)單抗識(shí)別抗原位點(diǎn)的情況；(5)采用常規(guī)方法制備染色體，分析雜交瘤細(xì)胞核型；(6)采用免疫親和層析純化腹水型單抗；(7)快速試紙鑒定單抗類型；(8)采用間接免疫熒光標(biāo)記法測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)，并檢測(cè)對(duì)比兩種單抗在不同腫瘤細(xì)胞株和細(xì)胞上的表達(dá)；(9)免疫組織化學(xué)檢測(cè)單抗對(duì)肝硬化組織、肝癌組織、癌旁組織的2IgB7-H3的表達(dá)；(10)利用間接免疫熒光法，研究單抗7D7

6、識(shí)別DCs上的表達(dá)情況。利用MTT法，研究B7-H3信號(hào)途徑在成熟DC體外活化T細(xì)胞過程中的作用；(12)采用ELISA法檢測(cè)自行制備的單抗對(duì)DC刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2和IL-10的影響；(13)細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTr法研究單抗7D7對(duì)H08910細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)成功獲得一株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人2IgB7-H3mAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為7D7；(2)單抗重鏈屬于小鼠IgGl亞類，輕連為K鏈；(3)染

7、色體核型分析提示該株雜交瘤是融合體細(xì)胞；(4)腹水型單抗7D7的效價(jià)是1：1000；(5)ProteinG親和層析，純化后抗體蛋白7D7的濃度達(dá)到2．57mg／ml；(6)單抗7D7、21D4(本校醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所己制備)識(shí)別完全不同的抗原表點(diǎn)；(7)單抗7D7可以特異性識(shí)別一些腫瘤細(xì)胞和2IgB7-H3／L929上的2IgB7-H3分子；(8)2IgB7-H3在幾乎所有的上皮來源的腫瘤細(xì)胞株上都有表達(dá)，而在其他來源的組織上卻很少檢測(cè)

8、到2IgB7-H3分子的表達(dá)，在靜止及活化的B、T淋巴細(xì)胞上都未測(cè)到2IgB7-H3的表達(dá)。用抗4IgB7-H3單抗21D4可以檢測(cè)到在未成熟和成熟的單核細(xì)胞來源的DC上4IgB7-H3的高表達(dá)，用7D7只能測(cè)到2IgB7-H3微量的表達(dá)。但是在EAhy926、ECV304和卵巢癌細(xì)胞株上可以檢測(cè)到高2IgB7-H3的高表達(dá)；(9)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示，某些肝硬化組織和癌旁組織能表達(dá)2IgB7-H3，但在肝癌細(xì)胞上卻不表達(dá)；(10)