人GL50基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建及功能性鼠抗人GL50單克隆抗體的研制.pdf

1、GL50(CD275，inducible costimulator ligand)分子是B7家族的新成員，與其特異性受體ICOS(CD275，inducible costimulator)分子結(jié)合所提供的共刺激信號(hào)在T細(xì)胞的活化、增殖、細(xì)胞因子的分泌以及B細(xì)胞的增殖、分化、抗體產(chǎn)生等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。GL50信號(hào)參與了機(jī)體的移植排斥反應(yīng)、抗腫瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病和過(guò)敏反應(yīng)等眾多免疫過(guò)程。轉(zhuǎn)染人GL50基因細(xì)胞及鼠抗

2、人GL50單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的研制能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究GL50在機(jī)體免疫應(yīng)答中的作用以及與其他共刺激信號(hào)通路之間的關(guān)系提供有力的工具，從而深入探討機(jī)體免疫應(yīng)答的本質(zhì)，同時(shí)也為臨床相關(guān)的疾病診斷、治療和預(yù)防提供了新的手段。
　　 第一部分轉(zhuǎn)染人GL50基因細(xì)胞株的建立及其對(duì)T細(xì)胞體外增殖與活化的促進(jìn)作用
　　 從人B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi中抽提總RNA，采用RT-PCR的方法，把總RN

3、A逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并大量擴(kuò)增目的基因。將目的基因插入pIRES2-EGFP載體中并測(cè)序，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組載體pIRES2-EGFP-GL50轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞。用G418篩選并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)與RT-PCR的方法反復(fù)鑒定，最終獲得了穩(wěn)定高表達(dá)GL50分子的L929/GL50基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。功能分析表明L929/GL50基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖，并可以顯著地促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-4和IL-17，而不影響IL-2的

4、分泌。
　　 第二部分功能性鼠抗人GL50單克隆抗體的研制
　　 以L929/GL50為免疫原，免疫Balb/c小鼠，采用經(jīng)典雜交瘤技術(shù)，將免疫后鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0進(jìn)行融合并經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)。以L929/GL50細(xì)胞作為陽(yáng)性篩選細(xì)胞株，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，對(duì)抗體分泌陽(yáng)性孔內(nèi)細(xì)胞反復(fù)篩選并經(jīng)多次的克隆化培養(yǎng)，最終獲得2株穩(wěn)定、持續(xù)分泌鼠抗人GL50單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2B4、4D1

5、1。這兩株雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)體外連續(xù)傳代(50代)培養(yǎng)，在液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍然生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分泌抗體性能穩(wěn)定。
　　 采用本科室建立的腹水誘生的方法制備單克隆抗體，腹水的平均產(chǎn)量為3～4ml/只小鼠。經(jīng)Protein G親和層析柱分離純化，兩株單克隆抗體純化后蛋白濃度在3～4mg/ml之間，間接免疫熒光標(biāo)記法分析表明，其效價(jià)在1:5000以上，用于間接免疫熒光分析時(shí)抗體蛋白的用量為0.2～2μg/1×106細(xì)胞。單克隆抗體核型分

6、析的結(jié)果顯示，兩株雜交瘤2B4與4D11的染色體數(shù)目都超過(guò)小鼠B細(xì)胞與SP2/0的染色體數(shù)目，約為100條左右，表明這兩株雜交瘤2B4與4D11為融合體。
　　 使用快速定性試紙條鑒定，單克隆抗體2B4與4D11的重鏈分別為IgG1、IgG2a，兩者輕鏈同為κ鏈。流式細(xì)胞術(shù)，Dot-blot與酶聯(lián)吸附的方法分析表明，單克隆抗體2B4與4D11均能夠與人GL50分子特異性結(jié)合?？贵w的抗原表位競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單克隆抗體2B4與