GL50分子在活化T細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞上的表達(dá)及其生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、GL50分子是新近發(fā)現(xiàn)的B7家族成員，為一個(gè)由309個(gè)氨基酸組成的I型跨膜糖蛋白，約45～72kDa，胞外區(qū)與B7家族其它分子相似。人GL50分子最早是1999年，由SwalowM．M．等分別從經(jīng)TNF活化的小鼠胚胎母細(xì)胞系和3T3細(xì)胞中克隆得到的。因?yàn)樗cAPC上B7分子同源，故命名為B7h。隨后Ling等在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選與B7家族基因相似的基因，獲得了KIAA0653(AccessionNumber：AB014553，Refl2

2、)的cDNA。該cDNA分子約3．4kg，定位于21號(hào)染色體上。人GL50可持續(xù)表達(dá)在B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面和心臟、骨骼肌、肺等組織上。GL50分子與其特異性受體ICOS(InducibleC0stimulator)的相互作用，在機(jī)體再次免疫應(yīng)答過(guò)程中T細(xì)胞的增殖、活化、分化、細(xì)胞因子的分泌以及B細(xì)胞的增殖、分化、抗體分泌等方面發(fā)揮著重要的作用。目前的研究證明：GL50／ICOS信號(hào)途徑在機(jī)體炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等免疫

3、應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。對(duì)該信號(hào)途徑的有效調(diào)節(jié)將不僅為理解人體復(fù)雜、精細(xì)的免疫應(yīng)答提供新的視角，而且還具有潛在的臨床應(yīng)用前景。 本研究擬在已經(jīng)成功構(gòu)建一株ICOS轉(zhuǎn)基因細(xì)胞ICOS．L929，并制備獲得了一株能穩(wěn)定分泌功能型鼠抗人GL50單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株nC4的工作基礎(chǔ)上，進(jìn)行如下研究： 1．GL50分子在活化T細(xì)胞上的表達(dá) 將人外周血T細(xì)胞用PHA或聯(lián)合抗CD3和抗CD28單抗激發(fā)后，分別于0h

4、、24h、48h、72h、96h用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測(cè)細(xì)胞表面GL50分子和ICOS分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)，結(jié)果顯示：GL50分子的表達(dá)在T細(xì)胞活化后24h即開(kāi)始上調(diào)，72h時(shí)達(dá)到高峰；而ICOS分子的表達(dá)在T細(xì)胞活化48h時(shí)達(dá)到高峰，由此表明：GL50和ICOS分子共表達(dá)于活化T細(xì)胞表面，并且兩者的表達(dá)在時(shí)相上存在差異性。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步用westernblot以及real-timePCR等方法從蛋白和基因水平證實(shí)了上述

5、結(jié)果。 2．GL50／ICOS信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的共刺激作用 將T細(xì)胞用抗人CD3激發(fā)型單抗或聯(lián)合抗CD3和抗CD28單抗激發(fā)，同時(shí)加入絲裂霉素處理的刺激細(xì)胞ICOS—L929或mook．L929，共培養(yǎng)3d后，經(jīng)MTT摻入法顯示，ICOS—L929細(xì)胞能有效地促進(jìn)T細(xì)胞增殖，而聯(lián)合抗CD28單抗，促增殖效應(yīng)則更為顯著。在ICOS．L929細(xì)胞處理的活化T細(xì)胞組中加入不同濃度特異性抗GL50單抗11C4后發(fā)現(xiàn)，阻斷GL50信號(hào)

6、能夠有效地抑制活化T細(xì)胞的體外增殖效應(yīng)。細(xì)胞表型分析ICOS．L929細(xì)胞能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞活化。同樣，細(xì)胞凋亡檢測(cè)表明，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞介導(dǎo)的GL50信號(hào)能促進(jìn)T細(xì)胞的抗凋亡能力。EUSA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子也表明，ICOS—L929細(xì)胞能明顯促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)IL一10的分泌，而阻斷GL50信號(hào)能夠明顯的降低IL—lO的分泌，對(duì)IL-2的分泌沒(méi)有顯著影響，上述結(jié)果顯示，活化T細(xì)胞誘導(dǎo)性表達(dá)的GL50分子具有增強(qiáng)活化T細(xì)胞的功能效應(yīng)。

7、 3．阻斷GL50信號(hào)對(duì)體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的增殖抑制 將T細(xì)胞(1×105／孔)和體外誘導(dǎo)的絲裂霉素處理(單向MLR)或未處理的(雙向MLR)成熟DC以20：l比例加入96孔板，加入不同濃度(5μg/ml和10μg／mD的GL50單克隆抗體11C4，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)小鼠IgG同型對(duì)照。MTT法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示：GL50單克隆抗體nC4能有效地抑制個(gè)體間混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的增殖(P

8、加，抑制作用更加明顯。 4．不成熟№一DC上調(diào)表達(dá)GL50分子 外周血單核細(xì)胞經(jīng)GM—CSF+IL4+TNF一α或者GM—CSF+IL4+CD40mAb常規(guī)方法誘導(dǎo)Mo．DC，繼而分別取不同時(shí)相(3，6，8，10d)Mo．DC，用商品化GL50單抗MiⅢ2．PE或本所自行研制的GL50單抗11C4標(biāo)記，F(xiàn)ACS分析結(jié)果顯示：不成熟的Mo．DC上調(diào)表達(dá)GL50分子，而隨著Mo．DC的誘導(dǎo)成熟，GL50的表達(dá)明顯下降。

9、 5．GL50介導(dǎo)的逆向信號(hào)體外促進(jìn)人Mo—DC的分化與成熟 經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)DC表型分析，在TNF．Α激發(fā)的基礎(chǔ)上，ICOS．L929細(xì)胞能進(jìn)一步上調(diào)DC表達(dá)CD80、CD86、CD83等分子，由此提示GL50信號(hào)具有促進(jìn)DC進(jìn)一步分化成熟的作用。隨后的M0．DC攝取FITC．Dextmn能力分析實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，聯(lián)合ICOS—L929細(xì)胞和TNF一α激發(fā)的Mo-DC的攝取能力較TNF-α激發(fā)的Mo—DC明顯減弱(P

10、述結(jié)果表明，通過(guò)GL50介導(dǎo)的逆向信號(hào)能促進(jìn)Mo—DC的進(jìn)一步分化成熟。而且EUSA法分析顯示，聯(lián)合ICOS．L929細(xì)胞和1NF-α刺激的M0一DC能促進(jìn)T細(xì)胞分泌更多IL．10，而對(duì)IL．2的產(chǎn)生則無(wú)明顯作用。由此提示：聯(lián)合ICOS—L929細(xì)胞和TNF-α刺激的DC能進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞向n2分化。 綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)了GL50在活化T細(xì)胞上的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)GL50信號(hào)能夠有效地促進(jìn)體外T淋巴細(xì)胞的增殖，GL50抗體11

11、C4能夠有效地阻斷GL50信號(hào)，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，并能抑制體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)?；罨疶細(xì)胞誘導(dǎo)性表達(dá)的GL50分子在活化T細(xì)胞的功能介導(dǎo)中具有正性促進(jìn)作用，這為進(jìn)一步研究效應(yīng)性T細(xì)胞精細(xì)調(diào)節(jié)提供新的思路。上述研究結(jié)果具有一定的創(chuàng)新性。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)GL50分子在不成熟Mo．DC表面呈現(xiàn)上調(diào)性表達(dá)，ICOS-L929細(xì)胞介導(dǎo)的GL50逆向信號(hào)能有效地促進(jìn)M0一DC的分化成熟，并且ICOS．L929細(xì)胞激發(fā)的Mo．DC能顯著地促進(jìn)體