HBV感染不同狀態(tài)下樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)研究.pdf

1、目的：樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是一種最具潛能的抗原提呈細(xì)胞，其對(duì)抗原進(jìn)行捕獲、加工，處理后提呈給組織相容性復(fù)合物(majorhistocompability complex，MHC)-Ⅰ、Ⅱ類分子，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖，在增強(qiáng)或調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起著決定性作用。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者DCs的相關(guān)研究目前愈來(lái)愈受到眾多學(xué)者的關(guān)注。本課題擬研究慢性乙型肝炎不同感染階

2、段外周血來(lái)源DCs的功能特點(diǎn)，比較DCs中HBV不同滴度時(shí)DCs的功能差異，并研究CpG ODN能否促進(jìn)DCs成熟，增強(qiáng)DCs功能，從而進(jìn)一步揭示HBV感染不同狀態(tài)下DCs的免疫功能。 方法：本研究對(duì)10例慢性乙型肝炎患者、10例HBV攜帶者及10例健康對(duì)照者外周血來(lái)源DCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DCs的表面分子HLA-DR、CD80、CD86的表達(dá)，ELISA檢測(cè)DCs培養(yǎng)上清IL-12水平，以比較DCs在慢性乙型

3、肝炎不同感染階段的功能特點(diǎn)；同時(shí)運(yùn)用熒光定量PCR的方法，對(duì)12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽(yáng)性患者及10例血清HBV-DNA陰性患者外周血來(lái)源DCs內(nèi)的HBV-DNA進(jìn)行了檢測(cè)，并比較DCs中HBV不同滴度時(shí)DCs的功能差異；通過(guò)予以含非甲基化CpG基序的寡脫氧核苷酸鏈(unmethylated CpG motif containingoligodeoxynucleotides，CpG ODN)干預(yù)，研究CpG ODN能否有效促進(jìn)

4、DCs成熟，增強(qiáng)DCs功能。 結(jié)果： (1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體外用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(加GM-CSF和IL一4)誘導(dǎo)人的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)來(lái)培養(yǎng)DCs， 24小時(shí)后可見貼壁單核細(xì)胞聚集成大小不等葡萄串狀，粘附于培養(yǎng)板底，第3天可見這部分細(xì)胞體積增大，第4天可見部分細(xì)胞懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液，第5天可見這部分細(xì)胞數(shù)

5、目增多，部分細(xì)胞出現(xiàn)許多毛刺。第7天培養(yǎng)液中飄浮著大量有明顯樹突狀的大個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)。將培養(yǎng)7天的DCs收集在透射電鏡下觀察，每個(gè)視野充滿DCs，可見細(xì)胞體積較大，細(xì)胞表面突起比較豐富，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，線粒體結(jié)構(gòu)較清楚，溶酶體豐富，核大而圓，核膜清晰，染色質(zhì)分布較均勻。慢性乙型肝炎患者及HBV攜帶者HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)率較正常對(duì)照組普遍降低，但HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)水平在慢性乙型肝炎患者及HBV攜

6、帶者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA檢測(cè)培養(yǎng)第7天DCs上清IL-12水平，發(fā)現(xiàn)在DCs培養(yǎng)上清液中，IL-12的表達(dá)水平在慢性乙型肝炎患者及攜帶者明顯低于正常人，而慢性乙型肝炎患者與攜帶者之間則無(wú)明顯差異。 (2)對(duì)12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽(yáng)性患者及10例血清HBV-DNA陰性患者外周血來(lái)源DCs內(nèi)的HBV-DNA進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：12例血清HBV-DNA陽(yáng)性患者，其中有7例其DCs內(nèi)可檢測(cè)到HBV-DNA，5例DC

7、s內(nèi)未檢出HBV-DNA，DCs內(nèi)HBV-DNA檢出率為58.3％。流式細(xì)胞儀分析顯示，正常人的HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)陽(yáng)性率均在58％以上，而慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽(yáng)性組及血清HBV-DNA陰性組HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)率較正常人組普遍降低，尤以血清HBV-DNA陽(yáng)性組下降更為明顯。7例DCs HBV-DNA陽(yáng)性組及15例DCs HBV-DNA陰性組HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)率亦較正常人

8、組普遍降低，尤以DCs HBV-DNA陽(yáng)性組下降更為明顯。DCs培養(yǎng)上清IL-12水平在血清HBV-DNA陽(yáng)性組明顯低于血清HBV-DNA陰性組及正常人組，血清HBV-DNA陽(yáng)性組又低于血清HBV-DNA陰性組。而IL-12的表達(dá)水平在DCs HBV-DNA陽(yáng)性組明顯低于DCs HBV-DNA陰性組及正常人組，DCs HBV-DNA陰性組又低于正常人組。相關(guān)分析顯示，DCs表面分子的表達(dá)及DCs分泌IL-12水平與血清及DCs HBV載

9、量均呈顯著負(fù)相關(guān)。 (3)將培養(yǎng)第6天的DCs，加入CpG ODN繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，透射電鏡觀察CpG ODN刺激后DCs與完全培養(yǎng)基對(duì)照組DCs相比，其表面的突起豐富、增粗，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，空泡減少甚至消失。用流式細(xì)胞儀分析顯示，CpG ODN刺激組CD80、CD86及HLA-DR的表達(dá)陽(yáng)性率在慢性乙型肝炎組、HBV攜帶者組及正常人組均完全培養(yǎng)基對(duì)照組明顯升高。完全培養(yǎng)基對(duì)照組HLA-DR、CD86、CD80的表達(dá)陽(yáng)性率在慢

10、性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn)：慢性乙型肝炎組及攜帶者組HLA-DR、CD86、CD80的表達(dá)陽(yáng)性率較正常人組明顯下降，但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無(wú)顯著性差異。CpG ODN刺激組HLA-DR、CD86、CD80的表達(dá)陽(yáng)性率在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn)：慢性乙型肝炎組HLA-DR、CD86的表達(dá)陽(yáng)性率較攜帶者組及正常人組明顯下降，但攜帶者組和正常人組之間比較卻無(wú)顯著性差異；慢性乙型肝炎組及攜帶

11、者組CD80的表達(dá)陽(yáng)性率正常人組明顯下降，但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無(wú)顯著性差異。ELISA檢測(cè)CpG ODN刺激組及完全培養(yǎng)基對(duì)照組IL-12的水平，發(fā)現(xiàn)CpG ODN刺激組DCs分泌IL-12的水平無(wú)論在慢性肝炎組、攜帶者組及正常人組均較完全培養(yǎng)基對(duì)照組明顯升高。完全培養(yǎng)基對(duì)照組及CpG ODN刺激組DCs分泌IL-12水平在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn)：慢性乙型肝炎組及攜帶者組DCs分泌IL-12水平較

12、正常人組明顯下降，但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無(wú)顯著性差異。 結(jié)論： (1)慢性乙型肝炎患者及無(wú)癥狀攜帶者均存在著DCs表型和功能的缺失。 (2)慢性乙肝患者外周血DCs亦能受到HBV的感染，而且DCs的表型以及分泌IL-12能力與血清及DCs內(nèi)HBV載量均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。 (3)CpG ODN能夠明顯促進(jìn)慢性乙型肝炎患者外周血DCs成熟，為CpG ODN成為治療慢性乙型肝炎的一種新方法提供了實(shí)