人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞上清作用下樹突狀細(xì)胞內(nèi)皮樣分化的研究.pdf

1、授予單位代碼學(xué)號(hào)或申請?zhí)?0459200612026100104004級(jí)公翁.文學(xué)論大位州學(xué)鄭士碩(科學(xué)學(xué)位)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞上清作用下樹突狀細(xì)胞內(nèi)皮樣分化的研究院系名稱:鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)科門類:醫(yī)學(xué)專業(yè)名稱:病理學(xué)與病理生理學(xué)作者姓名:白睿華導(dǎo)師姓名、職稱:董子明教授2009年05月26日鄭州大學(xué)2009屆碩士學(xué)位論文中文摘要研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌SW62o細(xì)胞上清能抑制未成熟nes(immaturedend‘tieee一15，iD

2、Cs)的生長過程及相關(guān)抗原表達(dá)，并且未成熟DCs在SW620細(xì)胞上清誘導(dǎo)下發(fā)生內(nèi)皮樣分化。這些研究揭示在腫瘤相關(guān)環(huán)境下DCs在抗腫瘤免疫方面受到抑制，部分DCS還發(fā)生內(nèi)皮樣分化。國內(nèi)外近年來關(guān)于DCS的研究多集中于如何提高DCs抗腫瘤的免疫功能等方面，而腫瘤微環(huán)境下DCS的內(nèi)皮樣分化發(fā)生及其機(jī)制等還有待于進(jìn)一步的研究。目的:本實(shí)驗(yàn)探討結(jié)腸癌細(xì)胞SW62O分泌的可溶性細(xì)胞因子營造的微環(huán)境對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的不同時(shí)期DCs發(fā)生內(nèi)皮樣分

3、化的影響，以及MAPKERK信號(hào)途徑在此過程中的激活情況。實(shí)驗(yàn)方法:1.制備結(jié)腸癌SW62O細(xì)胞上清液。2.采集健康志愿者新鮮外周血，密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，即Ml1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3x106ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，移入二氧化碳孵育箱(5%COZ，37℃)靜置3h，去除懸浮細(xì)胞，獲取貼壁生長的單核細(xì)胞，加入含thGM一eSF(100nginl)、IL一4(sn留ml)和10%自體血清的1640

4、培養(yǎng)液，第5d加入LPs(5n歲ml)。誘導(dǎo)組除加入上述培養(yǎng)液外，分別于第Zd(未成熟DCs誘導(dǎo)組)、第7d(成熟DCs誘導(dǎo)組)分組加入sW62o細(xì)胞上清液。隔天半量換液，各誘導(dǎo)7d。分別于第9d和14d收集誘導(dǎo)組細(xì)胞和對(duì)照組DCs。培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)提取各組細(xì)胞總蛋白，Westemblotting檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志vWF、VE一cadherin的表達(dá)情況透射電鏡觀察WP小體增殖及殺傷實(shí)驗(yàn)觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞抗原呈遞功能的改變乙

5、酞化低密度脂蛋白攝取實(shí)驗(yàn)(DIL一Ac一LDLuPtakeassav)了解誘導(dǎo)后細(xì)胞是否具有內(nèi)皮細(xì)胞的功能westemblotting檢測sW62o細(xì)胞上清液對(duì)未成熟DCs刺激后15、30、60min的E雙122水平的影響。使用ERKI2上游激酶MEK的阻斷劑PD98059，觀察MAP玲ERK通路阻斷后，SW620細(xì)胞上清誘導(dǎo)組細(xì)胞vWF、VE一cadherin的蛋白表達(dá)情況和DIL一Ac一LDL攝取功能。3.胰蛋白酶法配合內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)