多聚乳糖胺型N-聚糖與結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620耐藥性的關(guān)系探討.pdf

1、目的：5-氟尿嘧啶(5-FU)是臨床治療結(jié)腸癌的最常用藥物之一。本文在5-FU處理結(jié)腸癌細(xì)胞SW620后,分析多聚乳糖胺鏈的表達(dá)水平變化;并檢測(cè)合成多聚乳糖胺鏈的糖基轉(zhuǎn)移酶β3GnT8基因和蛋白水平的表達(dá)變化。同時(shí)為了進(jìn)一步闡明多聚乳糖胺鏈及糖基轉(zhuǎn)移酶β3GnT8與結(jié)腸癌細(xì)胞5-FU耐藥性的相關(guān)性,以耐藥細(xì)胞株SW620/5-FU為研究對(duì)象,檢測(cè)耐藥細(xì)胞株中多聚乳糖胺鏈和糖基轉(zhuǎn)移酶β3GnT8的表達(dá)水平,初步探討多聚乳糖胺鏈及糖基轉(zhuǎn)移酶

2、β3GnT8與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的關(guān)系。
　　方法：⑴MTT藥物敏感實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定5-FU處理SW620細(xì)胞后細(xì)胞的半數(shù)致死率(IC50);Hochest33258試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5-FU處理SW620細(xì)胞后細(xì)胞凋亡程度變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5-FU處理SW620細(xì)胞后細(xì)胞周期變化;流式細(xì)胞術(shù)和Lectin-blot分別檢測(cè)5-FU處理SW620細(xì)胞后細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)多聚乳糖胺鏈的表達(dá)變化;堿性磷酸酶試劑盒ALP/AKP檢測(cè)5-FU

3、處理SW620細(xì)胞后細(xì)胞分化指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP/AKP)的活性變化;Western-blot檢測(cè)糖基轉(zhuǎn)移酶β3GnT8和CD147在蛋白水平的表達(dá)情況。⑵利用逐步遞增濃度間歇作用法篩選耐藥細(xì)胞株SW620/5-FU;MTT藥物敏感實(shí)驗(yàn)測(cè)定耐藥細(xì)胞株SW620/5-FU的耐藥指數(shù);Real-time PCR檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白 P-糖蛋白(P-gp)基因的mRNA水平表達(dá);Western-blot檢測(cè)耐藥細(xì)胞株SW620/5-FU和SW6

4、20中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133蛋白表達(dá);Hoechst33258試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩株細(xì)胞的凋亡情況;Real-time PCR和Western-blot分別檢測(cè)耐藥細(xì)胞株SW620/5-FU及SW620中β3GnT8的mRNA和蛋白水平表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)和Lectin-blot分別檢測(cè)兩株細(xì)胞的細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)多聚乳糖胺的表達(dá)。
　　結(jié)果：①5-FU處理SW620細(xì)胞后,細(xì)胞的凋亡程度升高,細(xì)胞周期主要抑制在S期,細(xì)胞表面及

5、細(xì)胞內(nèi)全部多聚乳糖胺鏈的表達(dá)均降低,且有時(shí)間依賴(lài)性,細(xì)胞分化程度升高;5-FU處理SW620細(xì)胞后,Western-blot檢測(cè)β3GnT8和CD147的蛋白水平表達(dá)變化,結(jié)果表明兩者表達(dá)均有顯著增加。②篩選得到耐藥細(xì)胞株SW620/5-FU,耐藥指數(shù)RI為7.62。其P-gp基因mRNA表達(dá)水平明顯高于SW620細(xì)胞;兩種細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133蛋白水平表達(dá)變化不大,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SW620細(xì)胞凋亡水平高于SW620/5-FU

6、細(xì)胞;以上結(jié)果均表明耐藥細(xì)胞株篩選成功。β3GnT8的基因和蛋白水平表達(dá)在兩株細(xì)胞中差異顯著,其在SW620/5-FU細(xì)胞中表達(dá)明顯高于SW620細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)和Lectin-blot檢測(cè)兩種細(xì)胞中細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的多聚乳糖胺鏈的表達(dá),結(jié)果顯示多聚乳糖胺鏈在SW620/5-FU細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于SW620細(xì)胞。
　　結(jié)論：⑴5-FU能夠促進(jìn)SW620細(xì)胞的凋亡,將細(xì)胞周期主要抑制在S期;5-FU能夠抑制多聚乳糖胺鏈的表達(dá),同

7、時(shí)也抑制了糖基轉(zhuǎn)移酶β3GnT8和細(xì)胞表面糖蛋白CD147的蛋白水平表達(dá)。推測(cè)5-FU處理SW620細(xì)胞后,因其抑制了β3GnT8的蛋白表達(dá)而影響多聚乳糖胺鏈的合成,細(xì)胞凋亡水平也進(jìn)而增強(qiáng),同時(shí)降低了CD147的表達(dá)。⑵篩選得到的5-FU耐藥細(xì)胞株SW620/5-FU高表達(dá)P-gp,SW620/5-FU細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)多聚乳糖胺鏈表達(dá)水平均高于SW620細(xì)胞,β3GnT8基因和蛋白水平表達(dá)也高于SW620細(xì)胞,而細(xì)胞凋亡水平低于后者。兩