人結(jié)腸癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　結(jié)腸癌是危害人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。研究認(rèn)為，腫瘤血管對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有重要作用，抗血管生成治療已成為腫瘤治療重要手段，但臨床報道部分病人抗血管生成治療效果不佳，甚至促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
　　腫瘤組織中存在一小部分具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，該細(xì)胞雖只占少部分，但與腫瘤的侵襲性生長、復(fù)發(fā)、耐藥性密切相關(guān)，這一小部分腫瘤細(xì)胞被稱為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞。已有研究表明，在膠質(zhì)母

2、細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)某些血管內(nèi)皮細(xì)胞來源于干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，提示在腫瘤形成過程中干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞具有腫瘤血管生成細(xì)胞的作用，可直接參與腫瘤微循環(huán)血管網(wǎng)的形成。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)是新發(fā)現(xiàn)的一種通過非內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的管道而形成的特殊血液供應(yīng)模式。我們的前期研究已發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中存在VM現(xiàn)象，且VM的存在可能與腫瘤細(xì)胞的“干性”密切相關(guān)。因此，本研究將結(jié)腸癌細(xì)胞在特定微環(huán)境下培養(yǎng)，分析結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)變化與分

3、化程度的關(guān)系，及其與干細(xì)胞特性的關(guān)系，并篩選干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，將其誘導(dǎo)分化，推測干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞可以模擬內(nèi)皮細(xì)胞功能形成VM，進(jìn)一步在特定環(huán)境下分化成為具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞。這對豐富結(jié)腸癌血管生成理論，及解決臨床抗血管藥物耐藥現(xiàn)象具有重要意義。
　　方法:
　　1)三種不同分化程度的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW480和HT29置于37℃，5％CO2孵化箱常規(guī)培養(yǎng)。
　　2)取生長旺盛的三種結(jié)腸癌細(xì)胞，在

4、含有內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)因子的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　3)利用Western bloting方法分析三種結(jié)腸癌細(xì)胞在含有內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)因子的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，其內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況。
　　4)利用Western bloting和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerasechain reaction，RT-PCR)分別檢測結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞隨著誘導(dǎo)天數(shù)的延長，內(nèi)皮

5、細(xì)胞特異性分子標(biāo)記在蛋白水平和mRNA水平表達(dá)的變化。
　　5)利用細(xì)胞免疫熒光方法檢測經(jīng)過內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞和普通 HCT116細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)記的原位表達(dá)的變化。
　　6)將干性較強的HCT116細(xì)胞進(jìn)行無血清懸浮法篩選干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，利用細(xì)胞免疫熒光檢測篩選的HCT116干細(xì)胞球干細(xì)胞相關(guān)分子CD133和Lgr5的表達(dá)情況。
　　7)將篩選的HCT116干細(xì)胞球置于內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，

6、通過Western bloting和免疫熒光檢測篩選的HCT116干細(xì)胞球在內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基及普通培養(yǎng)基中內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)記的表達(dá)變化。
　　8)進(jìn)一步采用Matrigel三維培養(yǎng)模型觀察內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基對HCT116干細(xì)胞球體外成管能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1)在內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)的三種結(jié)腸癌細(xì)胞，隨著誘導(dǎo)時間的延長，低分化的HCT116細(xì)胞逐漸貼壁，呈多角形，細(xì)胞長滿后呈“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)，第15天，細(xì)胞呈

7、現(xiàn)“管道”樣結(jié)構(gòu)。中分化的SW480細(xì)胞由短梭形逐漸呈長梭形，細(xì)胞長滿后有形成“管道”樣的趨勢，但不明顯。高分化的HT29細(xì)胞經(jīng)過血管內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基持續(xù)誘導(dǎo)半個月，基本無變化。
　　2)Western bloting結(jié)果顯示，三種結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)過內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)15天后，分化差的HCT116細(xì)胞CD31、CD34表達(dá)增強最顯著(P＜0.05)，而中分化的SW480細(xì)胞和高分化的HT29變化并不明顯。
　　3)根據(jù)Wester

8、n bloting、 RT-PCR結(jié)果和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞在內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天后，隨著誘導(dǎo)天數(shù)的延長，其內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)記表達(dá)量逐漸增強。
　　4)根據(jù)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，篩選的HCT116干細(xì)胞球的可以表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)分子CD133和Lgr5。
　　5)根據(jù)Western bloting和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，篩選的HCT116干細(xì)胞球在內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天后，隨著誘導(dǎo)天數(shù)的延長，其內(nèi)皮

9、細(xì)胞特異性分子標(biāo)記表達(dá)強度逐漸增強。
　　6)Matrigel三維培養(yǎng)模型觀察結(jié)果顯示，HCT116干細(xì)胞球在內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行對比分析表明:三維培養(yǎng)條件下，經(jīng)內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)可以促進(jìn)HCT116干細(xì)胞形成管道樣結(jié)構(gòu)，并縮短其形成管道樣結(jié)構(gòu)的時間。
　　結(jié)論:
　　1)結(jié)腸癌細(xì)胞具有在體外內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行定向誘導(dǎo)的能力。
　　2)結(jié)腸癌細(xì)胞在內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天后，其細(xì)胞形態(tài)的變化及內(nèi)

10、皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)記表達(dá)變化與分化程度呈負(fù)相關(guān)。分化程度低的結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)逐漸形成“管道”樣結(jié)構(gòu)，且內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)記表達(dá)變化最顯著，分化程度高的形態(tài)及內(nèi)皮特異性分子標(biāo)記表達(dá)基本無變化。
　　3)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116在內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天后，其內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)記表達(dá)量增強，表明結(jié)腸癌細(xì)胞具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化的特性。
　　4)血管內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基能促進(jìn)具有較強干細(xì)胞樣特性的結(jié)腸癌細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化