hbv分子生物學(xué)

1、HBV分子生物學(xué),陳忠斌　　博士軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所電磁與激光生物學(xué)研究室,在國(guó)內(nèi)因Ｂ型肝炎最為嚴(yán)重，加上會(huì)演變成慢性肝炎，肝硬化甚至肝癌，所以對(duì)人健康之威脅最大。,HBV的危害性,Clinical and Epidemiologic Correlations in HBV Infection,N Engl J Med 359:1486, October 2, 2008,350 million HBV carriers

2、worldwide,,,HBV350 Million,HCV185 Million,乙肝病毒（HBV）與乙型肝炎,☆ 乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）☆ 可引起肝臟急性、慢性感染，肝硬化和肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）☆全世界HBV攜帶者數(shù)量已達(dá)到3億5千萬(wàn)☆每年死于HBV導(dǎo)致的肝癌患者數(shù)量超過(guò)100萬(wàn)☆我國(guó)大約有1億2千萬(wàn)的HBV攜帶者,慢性乙肝是

3、一種潛在威脅生命的疾病。 全球每年有超過(guò)50萬(wàn)人死于原發(fā)性肝癌，而其中多達(dá)80％的原發(fā)性肝癌是由慢性乙肝引起的。在4億慢性乙肝患者中，有75％生活在亞洲，而中國(guó)是全球乙肝和肝癌負(fù)擔(dān)最沉重的國(guó)家。中國(guó)大陸的HBV流行率最高，這里的HBV病毒攜帶者占全球總數(shù)的1/3以上。據(jù)估計(jì)，中國(guó)大陸有1.2-1.3億乙肝病毒攜帶者。中國(guó)臺(tái)灣的慢性HBV感染率為15-20%，估計(jì)有300萬(wàn)乙肝病毒攜帶者。韓國(guó)約有225－227萬(wàn)乙肝病毒攜帶者。印

4、度的乙肝病毒攜帶者估計(jì)達(dá)3400萬(wàn)。新加坡慢性HBV感染率為4％，約有15萬(wàn)乙肝病毒攜帶者?！　》坡少e的慢性HBV感染率為5-16%。泰國(guó)慢性HBV感染率為3-6%，約有300萬(wàn)乙肝病毒攜帶者。香港地區(qū)慢性HBV感染率為8.8%，約有70萬(wàn)乙肝病毒攜帶者。,病毒學(xué)分類(lèi): Hepadnaviridae, Orthohepadnavirus: HBV,WHV, GSHV Avihepa

5、dnavirus: DHBV 病毒結(jié)構(gòu)和大小: Env（HBsAg;大,中,小) Dane’s particle 42nm HBcAg Core DNAP HBV-DNA,乙 型 肝 炎 病 毒,乙肝病毒的結(jié)構(gòu),HBV

6、virions (Dane particles),20-nm HBsAg particles,Structure of HBsAgAssociated Particles (Phosphotungstic Acid–Negative Stain).,HBV病毒學(xué),嗜肝DNA病毒科，基因長(zhǎng)3.2kb4個(gè)開(kāi)放讀碼框架：Pre-S/S、Polymerase、 Precore/core、XCore promoter和Precore區(qū)變異

7、X蛋白與肝癌的發(fā)生有關(guān)cccDNA是HBV復(fù)制的模板大多數(shù)抗病毒藥物對(duì)cccDNA的作用小或無(wú)作用,HBV genome and proteome,S PreS1 ,Pre-S2, S (PreS1 ,Pre-S2, PHSA-R, S) C Pre-C, C ORFs

8、 (HBcAg, HBeAg) P DNA p (DNAp) X Xgene (HBxAg),病毒的基因組 HBV基因組又稱(chēng)HBV-DNA,由3200bp組成,為環(huán)狀部分雙股DNA,分長(zhǎng)(L),短(S)兩股,L鏈含4個(gè)開(kāi)放讀碼區(qū)(Open reading fr

9、ame; ORF),,乙肝病毒的分生檢驗(yàn),掌握血清中HBV-DNA的提取方法及原理，HBV-DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測(cè)定原理了解核酸測(cè)定引物設(shè)計(jì)原理，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的工作原理及操作要求： 復(fù)習(xí)“生物大分子的分離純化”及“聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)”章節(jié),病毒抗原抗體系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果分析,,,,,,介紹血清中病毒DNA的提取方法和原理學(xué)生分組提取血清中HBV-DNA介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測(cè)定原理介紹一般核酸測(cè)定引物設(shè)計(jì)原

10、理介紹HBV-DNA測(cè)定引物設(shè)計(jì)思路,,1. DNA提取方法有哪些？2. PCR原理是什么？實(shí)時(shí)熒光PCR原理與普通PCR的什么不同？,乙型肝炎預(yù)防方法-疫苗注射最有效是接受乙型肝炎疫苗注射?疫苗一共需要注射三次，第一和第二次相隔一個(gè)月，第二和第三之相隔五個(gè)月。?依時(shí)接受三次疫苗注射后，大約90-95%的人可以產(chǎn)生長(zhǎng)期的免疫力。?接受乙型肝炎預(yù)防疫苗之前，應(yīng)該預(yù)先檢驗(yàn)血液，只有從未被乙型肝炎感染過(guò)的人，才需要接

11、受疫苗注射。,乙肝病毒細(xì)胞模型和動(dòng)物模型,沒(méi)有可感染的細(xì)胞模型只有穩(wěn)定整合HBV基因組的細(xì)胞系： HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)基因鼠；動(dòng)物HBV：土撥鼠肝炎病毒（WHBV）、鴨肝炎病毒（DHBV）,抗乙型肝炎病毒治療,①抑制病毒復(fù)制，減少傳染性；②改善肝功能；③減輕肝組織病變；④提高生活質(zhì)量；⑤減少或阻止肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌 的發(fā)生。,抗病毒治療的目的,慢性乙型肝炎抗病毒治療難度,?慢性HBV感染難清除

12、 ● 嬰幼兒期感染, 免疫耐受性? HBeAg(–)慢性乙型肝炎復(fù)發(fā)率很高? HBV cccDNA難消失 ● cccDNA 與肝細(xì)胞“共存亡” ●只要cccDNA存在, 復(fù)制不會(huì)停止 ● 當(dāng)前尚無(wú)藥物能直接作用于cccDNA,乙肝的綜合治療,? 抗病毒治療? 免疫調(diào)節(jié)治療? “保肝”治療? 中醫(yī)藥治療? 基礎(chǔ)治療及心理治療? 基因治療,抗病毒藥物種類(lèi),目前尚無(wú)一種能迅速、直接殺死清除乙肝

13、病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達(dá)到50％左右。目前國(guó)際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類(lèi)：? ?干擾素：如賽若金（重組人α-1b干擾素）、 進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)α- 2a，α-2b干擾素等。? 核苷類(lèi)似物：拉米夫定、泛昔洛韋等。,Approved treatments for chronic hepatitis B,Standard interferon(IFN), Pegylated IFN

14、, Lamivudine (LAM)-拉米夫定, Adefovir dipivoxil (ADV)-阿德福韋, Entecavir (ETV)-恩替卡韋, Telbivudine(LdT),干擾素,1990年美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)干擾素α-2b（商品名：甘樂(lè)能）治療慢性乙型肝炎．1991年美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)干擾素α-2b（商品名：甘樂(lè)能）治療慢性丙型肝炎．1998年FDA批準(zhǔn)干擾素α-2b（商品名：甘樂(lè)能）聯(lián)合利巴韋林治療慢性丙

15、型肝炎，成為慢性丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)治療方案．,拉米夫定,【別名】賀普丁, 拉米夫定【外文名】Lamivudine， Heptodin,賀維力(阿德福韋酯Hepsera),葛蘭素史克公司出品的最新抗乙肝病毒新藥 （賀維力 片劑）          制造商 葛蘭素史性狀    本品為類(lèi)白色片,恩替

16、卡韋,是一種有效的、選擇性抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷類(lèi)似物,由Bristol-Myers Squibb 公司研究開(kāi)發(fā), 用于治療乙型肝炎。體外試驗(yàn)表明,恩替卡韋比其他核苷類(lèi)似物更有效。動(dòng)物模型和人體臨床研究結(jié)果顯示,恩替卡韋具有極強(qiáng)的抑制乙型肝炎病毒復(fù)制,降低血清病毒DNA 水平的作用,對(duì)耐拉米夫定的突變病毒株仍然有效, 且未見(jiàn)明顯的不良反應(yīng)和線(xiàn)粒體毒性。,2005年3月31日，美國(guó)FDA 批準(zhǔn)百時(shí)美施貴寶（Bristol-M

17、yers Squibb）公司了恩替卡韋（entecavir）．,現(xiàn)有乙肝抗病毒藥物中，核苷類(lèi)藥物初治患者4年的耐藥發(fā)生率分別為： 拉米夫定 71%， 阿德福韋 18%， 恩替卡韋<1%。,N Engl J Med 359:1486, October 2, 2008,N Engl J Med 359:1486, October 2, 2008,N Engl J Med 359:1486

18、, October 2, 2008,Serological signs of emergence of a drug-resistant mutant,Alan Kay, Fabien Zoulim. Virus Research 127 (2007) 164–176,HBV polymerase drug-resistant mutants,Alan Kay, Fabien Zoulim. Virus Research 127 (20