分子生物學(xué)與臨床

1、分子生物學(xué)與臨床天津市第三中心醫(yī)院劉樹業(yè),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)已逐漸應(yīng)用于遺傳性疾病、腫瘤及感染性疾病等方面的診斷。 1 . 檢測臨床標(biāo)本中病原體核酸序列。 2 . 腫瘤基因突變情況。 3 . 遺傳性疾病的基因序列。 4 . 人類白細(xì)胞表面抗原（HLA）配型。 5 . 法醫(yī)學(xué)方面的鑒定工作。,,PCR技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的價(jià)值,,優(yōu)點(diǎn)：1. 靈敏

2、度高，理論上，只要標(biāo)本中含有一個(gè)分子的DNA或RNA就可以作出診斷。2. 特異性強(qiáng)，對于一個(gè)19核苷酸的引物來說，非特異性配對的概率為419 = 2.75*1011這表示要與這19個(gè)堿基的排列順序完全相同時(shí)需要的基因組DNA片段的最小長度，而人的基因組長度為3*109堿基對，以克服血清學(xué)診斷有交叉反應(yīng)的缺陷。3. 可以早期診斷，如在HCV的感染中，第一周內(nèi)就可以檢測出HCV RNA，而抗體的產(chǎn)生一般在第二周以后。,PCR在診斷病原

3、體感染時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn),4. 對于體液免疫力低下或使用免疫抑制劑而無抗體產(chǎn)生者，PCR卻可以作出明確診斷。5. 可以對病原體作定量分析，反映病原體在機(jī)體的復(fù)制及動(dòng)力學(xué)變化情況。6. 可對病原體進(jìn)行基因分型。指導(dǎo)臨床治療。,,,不足之處:,1.操作復(fù)雜，技術(shù)不易被熟練掌握。2.價(jià)格昂貴。3.出于敏感性太高，操作步驟多而復(fù)雜，即使有極少量的污染也會(huì)造成假陽性。4.由于操作復(fù)雜，對試劑及實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，稍有差錯(cuò)就會(huì)出現(xiàn)假陰性。,幾點(diǎn)

4、認(rèn)識,一.今后儀器和試劑的發(fā)展方向：封管、定量及自 動(dòng)化；二.樣品采集方式對PCR很重要，比操作更重要。三.內(nèi)標(biāo)作用：操作過程的監(jiān)控、控制假陰性。四.從核酸提取、擴(kuò)增到檢測，對照與待測標(biāo)本 同步進(jìn)行；,,五.禁用產(chǎn)物的電泳分析技術(shù)。六.探針雜交技術(shù)和防污染技術(shù)的采用是一大 進(jìn)步。,,,一.標(biāo)本的采集,常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等

5、樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者皮屑或分泌物的污染。采樣時(shí)必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ髅蟪：胁灰资Щ畹腞NA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。

6、臨床用于RNA（如HCV RNA）擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。,,二.標(biāo)本的穩(wěn)定化處理,用于DNA擴(kuò)增檢測的標(biāo)本，采集后一般不需特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標(biāo)本有時(shí)必須進(jìn)行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場采樣。異硫氰酸胍鹽（Guanidine thiocyanat

7、e,GITC）可使 DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1∶4的比例加至含有5mol/L GITC的試管內(nèi)中，從而使血清（漿）中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項(xiàng)目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測定方法來評價(jià)。,,三.標(biāo)本的運(yùn)送,標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過郵寄運(yùn)送。如用于DNA擴(kuò)

8、增檢測的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA擴(kuò)增檢測的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本，通常在運(yùn)送時(shí)，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。,,四.標(biāo)本的貯存,臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于-70℃下長時(shí)間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10 mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液（pH 7.5-8.0）中4℃保存，用于 RNA測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液

9、中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用 GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天。,,五.標(biāo)本的處理（核酸提?。?標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對其進(jìn)行充分評價(jià)以驗(yàn)證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）或核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑（如酚、氯仿等），這

10、些物質(zhì)對其后的Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測定。當(dāng)標(biāo)本為痰時(shí)，則必須先進(jìn)行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過長。此外，當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定失敗的常見原因是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理(血清或血漿按1∶4的比例加至含有5mol/L GITC的試管內(nèi)中，從而使血清（漿）中的RNA酶不可逆失活)及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟

11、，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。對于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。,,一.內(nèi)源性物質(zhì)(影響因子）,1.類風(fēng)濕因子2. 補(bǔ)體3.嗜異性抗體4.嗜靶抗原的自身抗體5.醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體6.交叉反應(yīng)物質(zhì)7.標(biāo)本中其它成分的影響,二.外源性物質(zhì),1.標(biāo)本溶血2.標(biāo)本受細(xì)菌污染3.標(biāo)本保存不當(dāng)4.標(biāo)本凝集不全5.標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響,,P

12、CR測定的臨床應(yīng)用及測定結(jié)果的臨床意義,結(jié)核分支桿菌病原學(xué)：結(jié)核分支桿菌復(fù)合群（MTBC）：人型結(jié)核分支桿菌、牛型結(jié)核分支桿菌、非洲型結(jié)核分支桿菌和田鼠型結(jié)核分支桿菌，后者無致病性。對人有致病性的主要是人型結(jié)核分支桿菌，牛型引起人類發(fā)病已很少見。此外分支桿菌報(bào)道有100余種，1994年國際公認(rèn)有56種，常用非結(jié)核分支桿菌（NTM）或其他分支桿菌（MOTT）的名稱。培養(yǎng)：15-20小時(shí)一代，2-4周 看到 培養(yǎng)基上的菌落?？咕委熀?/p>

13、需4-8周或20周才出現(xiàn)菌落。,,引物設(shè)計(jì)： 結(jié)核分支桿菌共有的靶序列：65KD人型結(jié)核分支桿菌特異的靶序列mpt40MTBC特有的靶序列，如IS6110插入序列rRNA序列，以16S-rRNA為模板—cDNA—擴(kuò)增，高度保守，TB有高達(dá)1000-10000拷貝數(shù)，具很高的靈敏度和特異性。注意問題：標(biāo)本處理—痰、胸腹水：液化劑，

14、 紅細(xì)胞裂解液,,臨床應(yīng)用評價(jià)：Tb 與其他分支桿菌區(qū)別：AIDS 鳥分支桿菌，龜分支桿菌TB 耐藥基因含菌量較低標(biāo)本分離TB敏感性：遠(yuǎn)高于直接涂片和培養(yǎng) 涂片鏡檢：10000-100000菌/ml，培養(yǎng)：10-100個(gè)活菌PCR：1-20 個(gè)結(jié)核桿菌，但不能鑒別死菌和活菌，不能反映抗結(jié)核治療的效果；還可見臨床無結(jié)核病證據(jù)涂片和培養(yǎng)均陰性而PCR陽性的情況，這在理論上可診斷結(jié)核，但臨床

15、上很難被醫(yī)師認(rèn)同，這涉及所謂金標(biāo)準(zhǔn)的問題，目前還遠(yuǎn)不能就此情況下PCR陽性的生物學(xué)意義和價(jià)值作出評價(jià)。,,沙眼衣原體Chlamydea trachomatis Ct,病原學(xué)：三個(gè)生物變種：沙眼生物變種—A-K12個(gè)血清型性病淋巴肉牙腫變種LGV—3個(gè)血清型，人是天然宿主鼠生物變種—鼠是天然宿主，不侵犯人，與鼠肺炎有關(guān)病原學(xué)檢驗(yàn)：涂片、抗原抗體檢測、核酸檢測,四種衣原體的性狀比較,,PCR：16SrRNA基因高度保守—衣原體屬

16、特異引物7.5kD 質(zhì)粒及MOMP(主要外膜蛋白)基因適于構(gòu)建種或型特異性引物根據(jù)沙眼衣原體內(nèi)源性質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)合成的一對引物:1:GGACAAATCGTATCTCGG;2:GAAACCAACTCTACGCTG.擴(kuò)增片段517,可擴(kuò)增15個(gè)已知血清型的沙眼衣原體.實(shí)驗(yàn)證明,此引物不擴(kuò)增其他眼部常見微生物和正常人核酸,而對臨床49例診斷為沙眼的標(biāo)本陽性率為63%,敏感性和特異性均超過細(xì)胞培養(yǎng)法和免疫熒光法與酶免疫法等常規(guī)方法,靈敏

17、度達(dá)到能檢出1個(gè)衣原體DNA分子.,,特別要注意的問題:取材: 一定要取到細(xì)胞臨床評價(jià)：金標(biāo)準(zhǔn)—培養(yǎng)免疫學(xué)：熒光—主觀判定 EIA—金葡、鏈球菌、淋球菌-交叉 反應(yīng) PCR： 假陰陽性,,人類組織相容性抗原(HLA),組織相容性（主要組織相容性復(fù)合體—MHC）系統(tǒng)的概念：有I、II、III類I類：HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-E，HLA-F，HLA-G，HLA-

18、H…L等II類: HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP，HLA-DO， HLA-DN，HLA-M,…等位點(diǎn)III類: 為補(bǔ)體系統(tǒng)C2，C4，Bf等。HLA抗原的分類: I 類和 II 類抗原多態(tài)性、共顯性遺傳：已發(fā)現(xiàn)的HLA基因位點(diǎn)(等位基因數(shù))約400左右,,HLA分型的基本方法血清學(xué)方法:基本原理—活的淋巴細(xì)胞表面有大量的HLA-A,HLA-B,HLA-C HLA-DR抗原,在與特異性的同型抗體結(jié)合后,有補(bǔ)體存在時(shí)會(huì)

19、被殺死,經(jīng)過染色，根據(jù)淋巴細(xì)胞被殺死的百分率,可以決定待測淋巴細(xì)胞是否具有某一特異性的抗原.細(xì)胞學(xué)方法:基本原理—檢測的抗原屬于HLA-DP，HLA-DQ兩個(gè)位點(diǎn)，如果兩種淋巴細(xì)胞表面抗原不同,在一起培養(yǎng)，不同抗原互相刺激，淋巴細(xì)胞增殖并向母細(xì)胞轉(zhuǎn)化；否則，這兩種細(xì)胞會(huì)保持不變。,,HLA分型的基本方法常用X射線處理已知HLA-DP，HLA-DQ特異淋巴細(xì)胞，失去增殖能力保持刺激能力，與待測淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，若不發(fā)生增殖和母細(xì)胞化

20、即認(rèn)為與已知特異性細(xì)胞同型，否則為不同型別淋巴細(xì)胞.HLA-DR基因分型:(例)序列特異性引物PCR法—合成19對引物,21管加公共引物—DR型別.,,HLA抗原：一.HLA—ABC抗原:與疾病相關(guān)HLA—A,B與器官移植的關(guān)聯(lián)沒有D的配型意義顯著,C無意義.二.HLA—D抗原:與器官移植配型相關(guān)DR座位上的等位基因數(shù)比AB座位上的少,在隨機(jī)人群中挑選到DR抗原配合的供體要比選擇AB抗原配合的供體容易,所以目前器官移植主要做D

21、R配型.,,遺傳病檢測,遺傳病是由基因在性細(xì)胞的突變引起的一。PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針法對已知突變熱點(diǎn)基因檢測：PCR-目的基因-膜 雜交 發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn) 合成正常及突變寡核苷酸探針一個(gè)等位基因有一種ASO探針,要證明待測標(biāo)本是否屬于這一等位基因,要進(jìn)行一次雜交顯示信號的操作,這對于致病基因有多個(gè)突變可能性的診斷(地中海貧血

22、在中國有18種突變類型,全球有100多種),操作繁雜甚至不可能.二。PCR擴(kuò)增特異等位基因在3’末端設(shè)計(jì)突變位點(diǎn),根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與否判斷突變的存在.,,,,三.限制性片段長度多態(tài)性分析突變位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)相關(guān) 出現(xiàn)新的電泳圖譜四.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)①PCR擴(kuò)增靶DNA;②將特異的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子;③將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠

23、電泳;④最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變.該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合臨床實(shí)驗(yàn)的需要.,,,不足之處.例如，只能作為一種突變檢測方法，要最后確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測序;電泳條件要求較嚴(yán)格;另外，由于SSCP是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來實(shí)現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會(huì)出現(xiàn)

24、當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時(shí)，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢.盡管如此該方法和其他方法相比仍有較高的檢測率.首先，它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變.Takao，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)，他認(rèn)為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測出來.另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DN

25、A分離，并且還可以進(jìn)一步提純.用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段.,,UNG酶/dUTP防污染系統(tǒng),本試劑盒中加入了dUTP以保證PCR只選擇性地?cái)U(kuò)增臨床中的靶DNA。UNG酶（尿嘧啶糖基化酶）能識別并催化酶解含有dUTP 的DNA結(jié)構(gòu)，但不會(huì)對含有dTTP 的DNA的結(jié)構(gòu)識別并催化酶解。 dUTP 不存在于自然的DNA中，只有運(yùn)用dUTP 替代dTTP的PCR反應(yīng)之中產(chǎn)生的擴(kuò)增子中存在。這種dU化的PCR產(chǎn)物與UN

26、G酶一起孵育后使其失去再被擴(kuò)增的能力，因UNG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖苷鍵，可去除dU，使無dU的位點(diǎn)阻止TaqDNA聚合酶的延伸。 UNG酶可從單鏈或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無作用。 UNG酶在正常PCR循環(huán)變性一步就可被滅活，所以對含dU的新的PCR產(chǎn)物沒有影響。,,腫瘤研究中的分子生物學(xué),腫瘤分為:癌,肉瘤,白血病/淋巴瘤癌:90%的人類腫瘤,起源內(nèi)胚層及外胚層上皮細(xì)胞肉瘤,

27、白血病/淋巴瘤起源中胚層細(xì)胞,包括肌肉,骨骼,血管,成纖維細(xì)胞以及血液和淋巴系統(tǒng)中的循環(huán)細(xì)胞腫瘤發(fā)展的多步性.病毒癌基因:腫瘤病毒:,,有致癌能力的DNA病毒 : ( 6個(gè)病毒家族)乙肝病毒, 猴病毒40, 多瘤病毒, 乳頭瘤病毒, 皰疹病毒, 痘病毒只有一類RNA病毒致癌—反轉(zhuǎn)錄病毒腫瘤抑癌基因的發(fā)現(xiàn): Hanis1960年,正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合—雜合體細(xì)胞不致瘤—正常細(xì)胞中具有腫瘤抑制基因—產(chǎn)生腫瘤表型的負(fù)調(diào)節(jié)物

28、—當(dāng)雜合體細(xì)胞某段染色體丟失后—細(xì)胞變?yōu)槟[瘤表型---這段染色體上有重要的腫瘤抑制基因,,抑癌基因:P53—多種腫瘤.早期發(fā)現(xiàn)腫瘤中P53表達(dá)增加,認(rèn)為是癌基因.正常P53基因抑制腫瘤形成,腫瘤中過量表達(dá)的是P53基因突變體—作為顯性抑制物影響P53功能—致癌P16,PTP多種抑癌基因WT1—腎母細(xì)胞癌DCC—結(jié)腸癌APC—家族性腺瘤息肉癌變廣義的講,許多在細(xì)胞繁殖中起正常作用的基因,如DNA修復(fù)基因，其突變也會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)

29、生,它們的存在間接地起到抑制腫瘤的作用,,臨床評價(jià)1、假陽性與假陰性2、陽性率與“金標(biāo)準(zhǔn)”3、臨床實(shí)踐是最重要的依據(jù),,遺傳病診斷,?地中海貧血：珠蛋白序列中的的十幾種點(diǎn)突變；3’-堿基特異的PCR或ASO.?地中海貧血:16號染色體珠蛋白序列中基因簇的三種大片段缺失；每條染色體上各有兩個(gè)緊密連鎖的?基因，故一對16號染色體上共有四個(gè)?珠蛋白基因（? ? /? ?）缺失1個(gè)?基因-- ?+珠蛋白合成障礙性貧血缺失2個(gè)?

30、基因-- ?0珠蛋白合成障礙性貧血缺失3個(gè)?基因-- HbH病缺失4個(gè)?基因（全部缺失）--Hb Bart’s胎兒水腫綜合癥非缺失型?珠蛋白合成障礙性貧血—不終止—HB constant spring,,,遺傳病診斷,甲型血友?。篨-連鎖隱性遺傳病，（長距離PCR技術(shù)）唐氏綜合癥（21三體）：三體形成—配子期； 智力低下，1/800全基因組分析法:多個(gè)具有多態(tài)性的位點(diǎn)進(jìn)行連鎖

31、分析。,,,生物芯片：PCR技術(shù)在HLA-DRB1基因配型中的應(yīng)用：序列特異性引物PCR（SSP-PCR）：,基因診斷是指檢測感染者體內(nèi)病毒核酸的有無,或含量多少來進(jìn)行病原學(xué)診斷的一類方法。病毒性肝炎基因診斷包括病毒基因種類及含量、基因分型、亞型和變異及準(zhǔn)種等的診斷。甲型肝炎和戊型肝炎無慢性化,且有較好的血清學(xué)診斷指標(biāo),故一般不需進(jìn)行基因診斷。HGV和TTV,病毒性肝炎的基因診斷,定性和定量PCR：定性檢測主要是用于未知感染者

32、的診斷,確定患者是否感染了肝炎病毒,結(jié)果分別報(bào)告為"陽性"或"陰性"。定量測定：己知感染者的抗病毒治療時(shí)動(dòng)態(tài)觀察療效,結(jié)果報(bào)告需以量來表示。如高出定量范圍上限，則需對標(biāo)本稀釋后再測,低于定量范圍下限時(shí),則報(bào)告小于××copies/ml,不能以"陰性"形式報(bào)告。,病毒性肝炎的基因診斷,肝炎病毒,甲型肝炎病毒與戊型肝炎病毒由消化道傳播，引起急性肝炎，不轉(zhuǎn)為慢性

33、肝炎或慢性攜帶者。乙型與丙型肝炎病毒主要由輸血、血制品或注射器污染而傳播，除引起急性肝炎外，可致慢性肝炎，并與肝硬化及肝癌相關(guān)。丁型肝炎病毒為一種缺陷病毒戊型肝炎病毒（HEV）庚型肝炎病毒（HGV）TT型肝炎病毒（TTV）SEN型肝炎病毒（HSV）,甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）,,HAV的生物學(xué)性狀,屬小RNA病毒科，直徑27nm，無包膜呈20面立體對稱外面為一獨(dú)立外殼，內(nèi)含一個(gè)單鏈RNA分

34、子,HAV的電鏡照片,Feinstone（1973）,HAV的結(jié)構(gòu),HAV的致病性,糞－口途徑傳播,口咽部或唾液腺中早期增殖,腸道與局部淋巴結(jié)中大量增殖,入血并形成病毒血癥,肝臟為最終靶器官（病毒直接損傷或免疫病理作用）,通過膽汁隨糞便排出體外,,,,,,,HAV的免疫性,HAV只存在單一的抗原抗體系統(tǒng)，即HAVAg和抗-HAV 無論顯性感染還是隱性感染均能誘生出高效價(jià)抗-HAV 抗-HAVIgM陽性是甲肝的確診依據(jù) IgM型抗

35、體在感染后僅持續(xù)存于3-6個(gè)月IgG型抗體則可存在多年,Time course of HAV infection,HAV的其他生物學(xué)特性,培養(yǎng)特性 原代肝細(xì)胞或恒河猴胚腎傳代株細(xì)胞對HAV敏感，生長緩慢，不引起細(xì)胞裂解抵抗力 比腸道病毒更耐熱，60℃1h不被滅活，100oC 5分鐘可滅活 對乙醚、酸處理（pH 3）均有抵抗力 氯消毒、紫外線照射、福爾馬林處理均可破壞其傳染性,常見癥狀,流感樣癥狀厭食惡心黃疸（眼部

36、及皮膚呈黃色）尿黃腹痛乏力,微生物學(xué)檢查,感染早期可檢測血清中的抗－HAV IgM流行病學(xué)調(diào)查可檢測抗－HAV IgG對已接種甲肝疫苗者檢測中和型抗－HAV抗體直接檢測抗原或用分子生物學(xué)方法檢測病毒RNA,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）,,HBV--DNA,病原學(xué)：HBV屬嗜肝DNA病毒科，部分雙鏈DNA，3200堿基對，10個(gè)亞型，序列表明不同亞型的變異為10%，同一亞型的變異為2%。檢測

37、：病原體抗原、抗體核酸臨床評價(jià)：,,HBV的基因組結(jié)構(gòu),3.2Kb不完全雙鏈環(huán)狀DNA，含4個(gè)ORF,,,可將微孔板包被有蛋白質(zhì)（如親和素或鏈霉親和素、抗Dig-抗體、牛血清白蛋白）或已知序列的核苷酸，此為通用型活化微孔板，任何探針末端只要含有相應(yīng)配體或與已知序列互補(bǔ)的核苷酸都可與相應(yīng)的活化微化板固相化。我們設(shè)計(jì)了HBV特異探針，其-端含-段與通用板已知序列互補(bǔ)的核苷酸，引物5'端修飾有生物素，HBV DNA PCR產(chǎn)物

38、與固相化探針雜交后，即可用酶標(biāo)親和素進(jìn)行酶呈色測定，并證實(shí)其測定敏感度至少高于普通電泳法100倍。,,HBV DNA定量測定的臨床意義,為臨床診斷提供更全面、精確的資料真實(shí)、全面地反映HBV感染、復(fù)制及病情變化過程 抗病毒治療的分子水平監(jiān)測用HBV DNA的血清濃度的變化來評價(jià)抗病毒藥物的療效,,①：熒光探針1 ②：熒光探針2 ③：引物④：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ⑤：Taq酶,擴(kuò)增及檢測

39、原理,a：變性，雙鏈模板裂解成兩條單鏈,b：退火，引物、熒光探針分別結(jié)合到單鏈模板的相應(yīng)位點(diǎn)，探針①3’端激發(fā)基團(tuán)和探針②5’端的發(fā)光基團(tuán)緊靠在一起，發(fā)出640nm的熒光,c：延伸，隨聚合反應(yīng)的進(jìn)行，結(jié)合在模板上的2條熒光探針被替換下來。,d：一個(gè)循環(huán)結(jié)束，生成2條雙鏈模板,,,不同臨床標(biāo)本組中的HBV DNA檢出率,,不同臨床標(biāo)本組中HBV DNA陽性的定量結(jié)果,,,,,,,,電鏡下的HBV,Dane 顆粒,HBV的小球形顆粒,HBV

40、的管形顆粒,HBV的復(fù)制,HBV的抗原組成,表面抗原HBsAg核心抗原HBcAg e抗原HBeAg,表面抗原HBsAg,存在于三型顆粒中是HBV感染的主要標(biāo)志分亞型（a, d/y, w/r, adr）產(chǎn)生抗-HBsPre S1、Pre S2及抗- Pre S1和抗- Pre S2,核心抗原HBcAg,僅存在于Dane顆粒中不易在血液中檢出可在感染的肝細(xì)胞表面存在刺激機(jī)體產(chǎn)生抗HBc（IgG、IgM）表明病毒在復(fù)制

41、,e抗原HBeAg,僅存在于Dane顆粒中游離存在于血液中為病毒復(fù)制及強(qiáng)傳染性的指標(biāo)產(chǎn)生抗－HBe，是預(yù)后良好的征象,HBV的其它生物學(xué)性狀,培養(yǎng) 黑猩猩動(dòng)物模型、鴨動(dòng)物模型 用分子生物學(xué)技術(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)成功抵抗力 抵抗力強(qiáng)于HAV 對低溫干燥紫外線耐受 不被70％乙醇滅活 100℃ 10分鐘可滅活,HBV的致病機(jī)制,免疫低下：HBsAg無癥狀攜帶者病毒變異：逃逸免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷：為

42、主免疫復(fù)合物性的免疫損傷：肝外損傷自身免疫反應(yīng)的免疫損傷：肝特異性脂蛋白抗原,HBV的傳染機(jī)制,傳染源 主要傳染源是患者或無癥狀HBsAg攜帶者傳播途徑 密切接觸 血液及體液 母嬰傳播 不嚴(yán)格集體預(yù)防接種、藥物注射 針刺、文身等,乙型肝炎的特點(diǎn),我國約有40%-60%人群曾受到過HBV的感染表現(xiàn)急性乙肝的僅占0.1%-1%，亞臨床30%-75%，慢性乙肝1%-5%，乙肝病毒攜帶7%-20%)

43、急性乙肝如治療不徹底，10%患者可轉(zhuǎn)為慢性乙肝,乙肝五項(xiàng)及HBV DNA的臨床意義,HBsAg、抗HBsHBeAg、抗HBe抗HBc （HBcAg）HBV DNA,乙型肝炎病毒抗原,特別是表面抗原,在血液中的濃度較高,現(xiàn)癥HBV感染——明確診斷。僅抗HBc單項(xiàng)陽性,也可在血清中檢測到 HBV DNA乙型肝炎的診斷往往不需要進(jìn)行病毒核酸的檢測?？共《局委煏r(shí),血清中的病毒核酸含量是反映病毒數(shù)量和復(fù)制活躍程度最可靠的直接指標(biāo)、動(dòng)

44、態(tài)觀察藥物療效的確切指標(biāo),特別是對于HBeAg陰性患者。,,預(yù)防及免疫,控制傳染源，切斷傳播途徑人工自動(dòng)免疫： 疫苗（血源性、基因工程)人工被動(dòng)免疫： 高效價(jià)人血清球蛋白（HBIg）,丙型肝炎病毒（hepatitis C virus）,,HCV的生物學(xué)性狀,40～60nm球形有包膜單正鏈RNA,,HCV的基因結(jié)構(gòu),,丙型肝炎的特點(diǎn),我國丙肝病毒攜帶者的比例在2%-5%隨著年齡的增長，丙肝病毒攜帶率亦增高易感人

45、群感染HCV后，慢性化的比例高達(dá)50%以上乙肝患者容易重疊HCV感染,,HCV的診斷及預(yù)防,檢查病毒RNA檢測抗HCV因HCV免疫原性不強(qiáng)及變異，目前尚無可用疫苗,,HCV-RNA,HCV是引起輸血后肝炎主要致病因子，因?yàn)檠蠬CV含量僅為HBV的千分之一，加之其免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗-HCV一項(xiàng)，至今HCV分離尚不成功，其檢測較HBV困難得多，因此分子生物學(xué)方法在此應(yīng)用顯得格外重要。,,丙型肝炎基因診斷及意義,結(jié)果判斷抗HCV(+

46、)伴ALT?，或已排除其他肝炎的慢性肝炎，可診斷為丙肝?？笻CV(+)，ALT N。必須檢測到HCV-RNA(+)（定性）才診斷丙肝。,,丙型肝炎基因診斷及意義,結(jié)果判斷抗HCV(-)，臨床懷疑丙肝。應(yīng)做HCV-RNA二次定性或有一次定量(+)，可診斷為丙肝。常見于免疫功能低下或缺陷、少數(shù)兒童和老人。急性丙肝抗HCV檢出率為50%--90%，應(yīng)檢測HCV-RNA?？共《舅幱弥委煴仨氂枚縋CR檢測反映藥物療效。,,HCV--RN

47、A,病原學(xué)：單鏈正股RNA 病毒基因組長度10KB，為一個(gè)連續(xù)的ORF，包含多個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的蛋白基因。HCV變異及其亞型：序列變異率在3.2-28%之間,不同國家和地區(qū)分離的毒株基因差異很大,同一患者在不同時(shí)期分離的毒株也有變異.HCV基因組分為I-IV型和若干亞型.,,定量檢測HCV—RNA:1.可用于急性丙肝的早期診斷,在HCV陽性之前2.可作為HCV感染有無傳染性的指標(biāo)3.作為抗病毒療效的指標(biāo),HCV的生物學(xué)性狀

48、,40～60nm球形有包膜單正鏈RNA,HCV的致病性與免疫性,傳播途徑似HBV是引起輸血后慢性肝炎和肝硬化的主要原因潛伏期： 4-8周無癥狀HCV攜帶者和慢性丙肝者多見誘發(fā)肝外損傷：腎小球腎炎 免疫力不牢固,丙型肝炎的特點(diǎn),我國丙肝病毒攜帶者的比例在2%-5%隨著年齡的增長，丙肝病毒攜帶率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高達(dá)50%以上乙肝患者容易重疊HCV感染,HCV的診斷及預(yù)防,檢查病毒RNA檢測抗HC

49、V因HCV免疫原性不強(qiáng)及變異，目前尚無可用疫苗,HCV的診斷及預(yù)防,丙型肝炎病毒：中國普通人群抗 ＨＣＶ抗體的陽性率為3 2%全世界約1 7億人感染了ＨＣＶ目前除了干擾素α(ＩＦＮ α)或其與利巴韋林聯(lián)合應(yīng)用對部分患者有一定療效疫苗研究：由于ＨＣＶ包膜糖蛋白Ｅ2中和性抗原位點(diǎn)存在高變區(qū)1(ＨＶＲ1)進(jìn)展甚微,ＨＣＶ抗原表位：線性表位、空間表位。如果以ＨＣＶ特異性抗體對化學(xué)合成的隨機(jī)噬菌體多肽庫進(jìn)行篩 選,則很難篩選到與原始的抗原

50、序列完全一致的序列,而是獲得大量與原始抗原序列完全不同的多肽片段。這種一級結(jié)構(gòu)序列與原始抗原不同,又保留其抗原反應(yīng)性的抗原表位,稱為模擬表位(ｍｉｍｏｔｏｐｅ)。從其結(jié)構(gòu)而言,模擬表位多數(shù)是構(gòu)象表位(ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｏｐｅ),即空間表位。噬菌體表面展示技術(shù)的建立和應(yīng)用促進(jìn)了ＨＣＶ抗原模擬表位的研究。國外學(xué)者應(yīng)用噬菌體表面展示技術(shù)篩選獲得了ＨＣＶ不同的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白抗原的模擬表位。這些研究結(jié)果首先在免疫學(xué)理論上闡

51、明了抗原 抗體分子之間相互對應(yīng)的多樣性的問題,同時(shí)由于模擬表位的抗原性較強(qiáng),且具有廣譜性,因此,在新型診斷試劑和廣譜疫苗的研究中具有重要的應(yīng)用前景。,,HCV的診斷及預(yù)防,丙型肝炎病毒感染的診斷,第三代血清學(xué)檢測試劑——較好的敏感性和特異性,但20%患者可不出現(xiàn)抗體,或有的患者抗體存在時(shí)間可以很長現(xiàn)行感染，早期診斷——因此,核酸檢測在HCV感染的診斷中要比HBV感染的診斷重要得多。,丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，H

52、DV）,HDV是一種缺陷病毒由HBsAg構(gòu)成其外殼HDV定位于肝細(xì)胞核內(nèi)，在血液中由HBsAg包被，形成35-37nm顆粒單負(fù)鏈環(huán)狀RNA,HDV的結(jié)構(gòu),Rizzetto于1977年首先發(fā)現(xiàn)，又稱? 抗原35-37nm球形顆粒；1.7Kb-ssRNA含9個(gè)ORF,丁型肝炎的特點(diǎn),只能感染HBsAg陽性的病人我國丁肝感染率在1.6%-5%，西南地區(qū)感染率高患者可不定期隔離，或隔離至肝功能正常，或HBsAg陰轉(zhuǎn)。病原學(xué)檢查

53、為HDAg、抗HD及HDV-RNA，持續(xù)高滴度IgG型抗HD是慢性HDV感染的主要血清學(xué)標(biāo)志。一旦乙肝患者感染了HDV，尤其是在慢性乙肝的基礎(chǔ)上感染，容易發(fā)展成為重度慢性乙肝、重型肝炎，甚至肝硬化。,微生物學(xué)檢查及預(yù)防,診斷為檢測抗-HDHDV-RNA丁型肝炎傳播途經(jīng)與乙型肝炎相似。傳播途徑和防治原則似HBV。,戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）,球形，無包膜直徑32～34nm單正鏈RNA，3個(gè)ORF兩

54、個(gè)血清型,,致病性及免疫,主要為糞－口途徑傳播由膽汁經(jīng)糞便排出體外對肝細(xì)胞的直接損傷及免疫病理作用多表現(xiàn)為急性戊型肝炎孕婦感染常致流產(chǎn),戊型肝炎的特點(diǎn),與甲型肝炎相比，患者黃疸前期癥狀重，病程持續(xù)時(shí)間較長，病死率較高，特別是孕婦感染HEV后。青壯年是HEV最喜歡攻擊的人群。戊型肝炎分兩種：“流行性” 多發(fā)生在雨季和洪水后， “散發(fā)性” 在秋冬季呈現(xiàn)高峰。傳染性強(qiáng)的時(shí)間在患者將要出現(xiàn)癥狀前(潛伏末期)至發(fā)病初期，患者的隔離期為

55、起病后3周。尚末發(fā)現(xiàn)有2次發(fā)病者。,微生物學(xué)檢查及預(yù)防,檢測HEV：EM或IEM檢測抗-HEV IgMHEV RNA預(yù)防與甲肝類似,TLMV病毒（TTV-liked mini virus, TLMV） ：2000年Takahashi TTV-DNA引物作PCR，檢測抗-HCV陽性血漿，10份TTV DNA滴度>105拷貝/ml，其中3份（分別為CBD231、279和203）血漿PCR產(chǎn)物的長度較預(yù)期為短（約1.2kb），

56、該病毒的全長DNA序列較TTV為短，分別為2 860nt（CBD231株）、2 856nt–BD279株）和2 897nt（CBD203株），證明是一種新病毒，命名為TTV樣微小病毒（TTV-like mini virus，TLMV）.,,準(zhǔn)種的研究：集中在RNA病毒（RNA病毒變異大，復(fù)制快，短時(shí)間內(nèi)感染個(gè)體中即可形成一個(gè)彼此密切相關(guān)的異質(zhì)性病毒群體.）HCV和HIV病毒的準(zhǔn)種特性：實(shí)質(zhì)是進(jìn)化的一種生存優(yōu)勢，病毒最大限度地&quo

57、t;制造"自己的大量變異序列，這些序列中可能包括了潛在有用的變異體，對抗病毒制劑有抵抗能力能逃避CTL攻擊和誘導(dǎo)免疫耐受的突變體. 這樣當(dāng)環(huán)境改變后病毒可以快速的作出反應(yīng)，從而保證其在宿主體內(nèi)的生存,,最近的研究還發(fā)現(xiàn)病毒準(zhǔn)種象人體免疫系統(tǒng)一樣具有記憶能力，當(dāng)準(zhǔn)種再次遇到經(jīng)歷過的環(huán)境作用時(shí)，保存在突變譜內(nèi)的少量病毒株將迅速大量復(fù)制成為準(zhǔn)種的主導(dǎo)序列.因此如果病毒準(zhǔn)種的復(fù)雜性越大，治療難度就可能越大.,,在HCV的研究中已發(fā)現(xiàn)

58、，病毒準(zhǔn)種的異質(zhì)性越大，對IFN-α的應(yīng)答性就越差DNA病毒的HBV也存在準(zhǔn)種特性. 已有少量的研究報(bào)道證實(shí)了這種假說，有關(guān)HBV準(zhǔn)種復(fù)雜性與IFN-α應(yīng)答性之間相關(guān)性研究尚未見報(bào)道. HBV不僅存在準(zhǔn)種特性，且在慢性乙型肝炎中準(zhǔn)種的復(fù)雜性和異質(zhì)性還很大. 同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在IFN-α應(yīng)答的患者中，準(zhǔn)種的復(fù)雜性明顯小于非應(yīng)答患者，這與在HCV的研究發(fā)現(xiàn)相一致.,,肝臟天然免疫系統(tǒng)的研究意義：肝臟NK細(xì)胞研究　NK細(xì)胞是天然免疫

59、的核心細(xì)胞,在腫瘤及病毒的免疫監(jiān)視中十分重要,國內(nèi)該領(lǐng)域研究十分薄弱。肝臟是機(jī)體天然免疫的核心器官,近3年才形成此概念,國際上研究亦十分薄弱,有望形成自有學(xué)科優(yōu)勢。,,DL C-1基因表達(dá)與肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RQPCR)研究位于8P的DLC l基因mRNA表達(dá)與肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。收集5l例復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院外科手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌(H C C)及癌旁正常組織標(biāo)本，根據(jù)臨床病理學(xué)指標(biāo)，分為高低侵襲性兩組，

60、用RQ—PCR對不同侵襲性H CC之間的DLC l基因表達(dá)進(jìn)行分析。對不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能Mtt CC 9 7一L．MHCC97一H、HCCLM3、Hep3B及HepG2肝癌細(xì)胞系用同樣方法分析DLC—l基因的表達(dá)差異。結(jié)果非轉(zhuǎn)移細(xì)胞系Hep3B和HepG2與轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MHCC97一L、MHCC97 H和ttCCLM 3之間DLC l基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0．01)，并隨著侵襲與轉(zhuǎn)移潛能的逐步提高DlJC l表達(dá)水下也相應(yīng)逐

61、步降低；HCCLM 3細(xì)胞系顯著低于MHCC97 L細(xì)胞系(P<0．01)。HCC組織中，高侵襲忡HCC組DLC—l基因表達(dá)明顯低于低侵襲性HCC組(P<0．05)。結(jié)論DI C—l基因表達(dá)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移的抑制相關(guān)，其表達(dá)可能在抑制肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。,RNA干擾技術(shù)用于抗乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究構(gòu)建針對乙型肝炎病毒表面抗原(IIBSAg)和核心抗原的小干擾RNA (siRNA)表達(dá)載體pSUper C，觀察其

62、對HepG2 2．2．1 5細(xì)胞(簡稱2、2．1 5細(xì)胞)中HBV DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯相應(yīng)蛋白的影響。根據(jù)RNA干擾(RNAi)作用原理設(shè)計(jì)針對IIBV核心區(qū)的相應(yīng)序列，再將其克隆入含聚合酶ⅢH l R NA 啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體PSUPe r，將此重組質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入2．2．1 5細(xì)胞中，用酶聯(lián)免疫吸附法(Abbott試劑)檢測培養(yǎng)上清液中HBsAg和e抗原(HBeAg)的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)酶切鑒定、電泳和測序分析證明，成功構(gòu)建了含作用序列

63、的重組質(zhì)粒pSUper C；但以電穿孔法轉(zhuǎn)染2．2．1 5細(xì)胞后末能發(fā)現(xiàn)其對2．2．1 5細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg和HBeAg的表達(dá)有影響。結(jié)論RNAi在2．2．1 5細(xì)胞中的作用還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。,乙型肝炎病毒cccDNA檢測的方法與臨床意義細(xì)胞外乙型肝炎病毒(HBV)DNA是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)分子，其兩條鏈均不是閉合的，其中負(fù)鏈較長，約3200個(gè)堿基，含有H

64、BV基因組的全長基因，在其5 起始端與3 末端之間有一數(shù)個(gè)堿基的“缺刻”；正鏈較短，有較大的“缺口”，其3 木端不固定，故長度是可變的，約為負(fù)鏈長度的50％～100％。在HBV的復(fù)制過程中，病毒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核，在DNA聚合酶的作用下，兩條鏈的缺口均被補(bǔ)齊，形成超螺旋的共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子(covalently closed circular DNA，cccDNA)。治療前后肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA~含量的變ft應(yīng)該納入

65、到抗一HBV藥物評價(jià)的指標(biāo)體系中來，從一定意義上說，只有能夠徹底清除HBV cccDNA的藥物，才能算是真正“有效”的抗病毒藥物。,cccDNA不同于rcDNA，后者存在于HBV核心中，外有核衣殼蛋白保護(hù)，因而在血液中是比較穩(wěn)定的；而cccDNA原本存在于肝細(xì)胞核中，不與蛋白共價(jià)結(jié)合，肝細(xì)胞被破壞釋放到血液中時(shí)從理論上講應(yīng)該是裸露的核酸分子，因此在血液中是否穩(wěn)定尚存疑問。但我們認(rèn)為HBV cccDNA是一種不斷折疊而形成的超螺旋結(jié)構(gòu)的D

66、NA分子，不同于一般的雙鏈DNA，既然用真核質(zhì)粒作載體的各種DNA疫苗能通過機(jī)體的各種屏障被機(jī)體攝取而不被破壞，我們推測類似結(jié)構(gòu)的乙型肝炎cccDNA在血液中應(yīng)該也是穩(wěn)定的。,SEN病毒：一種新近發(fā)現(xiàn)的肝炎病毒？1999年P(guān)rimi等在1例感染人類免疫缺陷病毒的靜脈毒癮者血清中分離出一種新的可能導(dǎo)致急、慢性肝炎的單鏈DNA病毒，并以該患者姓名的首位字母暫時(shí)命名為SEN病毒（senvirus，SENV）。SENV是一種無包膜、線狀單股

67、負(fù)鏈DNA病毒，長度約為3800kb。SENV的開放讀碼框（ORF）1氨基酸殘基為642～762個(gè)，N末端富含精氨酸/賴氨酸區(qū)相對保守。SENV的ORF1具有3個(gè)Rep蛋白基序。SENV的ORF2含有146～166個(gè)氨基酸。ORF3與ORF1的3′端序列部分重疊，有81～88個(gè)氨基酸組成，在ATG起始密碼子上有一個(gè)TATA功能區(qū)。它與經(jīng)輸血傳播病毒（TTV）原型株的核酸序列同源性低于50%，氨基酸序列同源性僅為3%。因此，它不是TTV親

68、緣關(guān)系較遠(yuǎn)的病毒變異株，而是一群不完全相同的病毒組成新的亞科的代表。目前至少可分為A～H等8個(gè)基因亞型，各型間氨基酸序列差異在15%～50%之間。在目前已知的8個(gè)基因亞型中，僅SENV－C/H和D亞型與慢性肝病關(guān)系密切。SENV兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)的基因位點(diǎn)變異頻率為7.32×10-4/年,病毒性肝炎藥物核 苷 類 似 藥,為一種強(qiáng)的單磷酸次黃嘌呤核苷脫氫酶抑制劑，阻礙病毒核酸合成。適應(yīng)證：用于腎綜合征出血熱和丙型肝炎治療劑 量

69、：口服0.8～1.0/d，3～4次分服副作用：有致畸和引起溶血，可致心肌損害和引 起呼吸困難。,利巴韋林（病毒唑，Ribavirin, Virazole）,適應(yīng)證：抗皰疹病毒，VZV病毒；其單磷酸鹽 （Ara-MP）可抑制HBV。副作用：消化道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝損害及骨髓 抑制等毒性反應(yīng)。注 意：不可靜脈推注，滴速應(yīng)慢，配制的液體