分子生物學(xué)培訓(xùn)總結(jié)

1、DNA自動(dòng)測(cè)序核酸分子雜交,RNA抽提純化和逆轉(zhuǎn)錄-PCR,載體與片段連接、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)總結(jié),質(zhì)粒抽提和酶切鑒定,,,重組DNA鑒定,,目的蛋白的表達(dá)及功能的研究,獲得目的基因,,,DNA重組,遺傳的中心法則,1958年Crick提出以DNA為中心的遺傳信息的傳遞規(guī)律，即DNA貯存的遺傳信息通過復(fù)制傳給子代DNA，通過轉(zhuǎn)錄傳給RNA，再通過翻譯傳給蛋白質(zhì)。遺傳信息傳遞方向的這個(gè)規(guī)律被稱

2、為～。,DNA,,RNA,,,,蛋白質(zhì),復(fù)制,復(fù)制,轉(zhuǎn)錄,翻譯,,反轉(zhuǎn)錄,1970年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)RNA病毒的RNA可通過反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄）將遺傳信息傳給cDNA，也可通過RNA復(fù)制或RNA轉(zhuǎn)錄傳給子代RNA，這是對(duì)中心法則的補(bǔ)充。1997年瘋牛病和朊病毒的出現(xiàn)，預(yù)示蛋白質(zhì)也可逆向?qū)⑦z傳信息向DNA傳遞。,,？,DNA的結(jié)構(gòu)及功能,DNA分子是由兩條反向平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤繞而成的。DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交

3、替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排在內(nèi)側(cè)。兩條鏈的堿基通過氫鍵連接形成堿基對(duì)，其中A與T配對(duì)，G與C配對(duì)。兩個(gè)相鄰脫氧核苷酸通過3’ -5’磷酸二酯鍵連接。起著貯存和傳遞遺傳信息的作用。,RNA的種類Category,轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(transfer RNA, tRNA) 核蛋白體核糖核酸(ribosome RNA, rRNA)信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA),轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白體,

4、起裝配機(jī)的作用翻譯蛋白質(zhì)的模板,RNA的功能Function,mRNA的生物合成mRNA Biosynthesis,真核生物的結(jié)構(gòu)基因由內(nèi)含子和外顯子組成，內(nèi)含子的序列較長(zhǎng)，且不編碼蛋白質(zhì)。真核生物DNA在轉(zhuǎn)錄過程中經(jīng)剪接可將內(nèi)含子部分去除，獲得成熟的mRNA。由于分子生物學(xué)研究的最終產(chǎn)物常常是蛋白質(zhì)，因此我們需要獲得可翻譯的mRNA。mRNA易降解，不易長(zhǎng)期保存。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用cDNA來研究基因的功能。

5、,Trizol提取RNA原理,Trizol法提取細(xì)胞總RNA是目前常用的提取方法。細(xì)胞內(nèi)大部分的RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白形式存在。 Trizol內(nèi)含異硫氰酸胍和苯酚等物質(zhì)。異硫氫酸胍(GuSCN)是一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，不僅能使細(xì)胞裂解，同時(shí)還能有效地抑制細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶的活性。通過有機(jī)溶劑的分步抽提，最終可獲得純度較高的細(xì)胞總RNA。,RNA提取注意事項(xiàng),Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮膚

6、接觸Trizol，請(qǐng)立即用大量水沖洗。 RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意隨時(shí)勤換手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)；盡量不要對(duì)著RNA樣品呼氣或說話。用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會(huì)降低最后得率，因?yàn)橐徊糠諶NA會(huì)殘留在未裂解的細(xì)胞中。在清洗和裂解細(xì)胞時(shí)最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。,逆轉(zhuǎn)錄(Rever

7、se Transcription),逆轉(zhuǎn)錄指遺傳信息從RNA流向DNA，是RNA指導(dǎo)下的DNA合成過程，即以RNA為模板，四種dNTP為原料，合成與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，稱為互補(bǔ)DNA ( complementary DNA, cDNA),逆轉(zhuǎn)錄原理,cDNA合成有兩個(gè)關(guān)鍵因素，一是病毒RNA的質(zhì)量，二是逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它能在一定的條件下，以單鏈RNA為模板合成第一條cDNA鏈。通過RNaseH活性水解R

8、NA-DNA雜合分子中的RNA鏈。,逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase),催化逆轉(zhuǎn)錄過程的酶稱逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA病毒中都含有此酶。 具有三種酶活性： RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶 RNA水解酶活性 DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶,,逆轉(zhuǎn)錄體系,RNA模板—— 3’UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA 5’,引物—— 5’ATCCGGAC,,逆轉(zhuǎn)錄酶,dATP,dGTP,dCTP,dTT

9、P,,Mn2+,,,酶活性依賴金屬離子,,,,,,底物,逆轉(zhuǎn)錄過程中cDNA的合成,逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇(Primer),Oligo(dT)(12-18個(gè)核苷酸組成），只有mRNA被逆轉(zhuǎn)錄隨機(jī)六聚寡核苷酸，所有RNA均被逆轉(zhuǎn)錄基因特異性引物，僅產(chǎn)生需要的DNA,逆轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義,擴(kuò)充了中心法則有助于對(duì)病毒致癌機(jī)制的了解與真核細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)育有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶是分子生物學(xué)重要工具酶,以DNA為模板，利用DNA聚合酶的特性體外擴(kuò)增特定的

10、基因片斷，這種方法被稱為DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。,,,,PCR 基因放大連瑣反應(yīng),聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR),PCR基本原理,利用高溫可使DNA變性和低溫可使DNA復(fù)性的特性，根據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中DNA半保留復(fù)制機(jī)理，以特異性寡核苷酸為引物， DNA分子為模板，在DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸存在的條件下體外合成新DNA分子的過程。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在

11、合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。,PCR技術(shù)的特點(diǎn),高度的敏感性高度的特異性操作簡(jiǎn)便、快速適用樣品的廣泛性,PCR基本成分,templateprimersTaq polymerase10×PCR bufferdNTPsMg++,PCR Primers,www.ncbi.nlm.nih.gov,PCR Primers,序列發(fā)現(xiàn)的時(shí)間和發(fā)現(xiàn)者序列的生物體來源序列的組織來源,引物設(shè)計(jì)(Primer design)

12、,引物長(zhǎng)度（length）: 20～30bp引物中四種堿基的分布應(yīng)該是隨機(jī)的兩引物間不能有互補(bǔ)序列，尤其是3‘端引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域由同源性引物的3’末端堿基一定要與模板DNA配對(duì)可以在5’末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或起始密碼解鏈溫度(Tm)：兩引物間相差不大于5℃引物內(nèi)部不能有大于3bp的反向重復(fù)序列或自身互補(bǔ)序列存在,PCR基本程序,預(yù)變性（Pre-denaturation)變性(Denaturation)

13、退火(Annealing)延伸(Elongation)25-30 cycles,Double stranded DNA template,Double stranded DNA template,,,Design primers with this sequence information,PCR CYCLE 1,Double stranded DNA template,,,Primers,Taq,Taq,PCR CYC

14、LE 1,Denaturation950Cstrands separate,,,Primers,Taq,Taq,Taq polymerase is thermostable,,,,,3’,5’,5’,3’,PCR CYCLE 1,Annealing~550CPrimers bind,Taq,Taq,,,,,3’,5’,5’,3’,PCR CYCLE 1,Annealing~550CTaq binds to duplex

15、,Taq,Taq,,,,3’,5’,5’,3’,,,PCR CYCLE 1,Extension72oCTaq copies DNA stranddNTPS,Taq,Taq,Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction,,,,3’,5’,5’,3’,,,,PCR CYCLE 1,Extension72oCTaq copies DNA strand,Taq,Taq,Taq sy

16、nthesises DNA in the 5’ to 3’ direction,,,,3’,5’,5’,3’,,,,,,PCR CYCLE 1,Extension72oCTaq copies DNA strand,Taq,Taq,Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction,,,3’,5’,5’,3’,5’,3’,,5’,3’,PCR CYCLE 1,End cycle 1,,PC

17、R animation,PCR反應(yīng),取無菌0?2ml PCR管一支，加入：10?PCR緩沖液 5μl氯化鎂 4μl4種ｄNTP混合液(10mmol/L) 0?5μl3?端引物(10μmol/L) 1μl5?端引物(10μmol/L) 1μlTaq DN

18、A多聚酶(5u/μl) 0?25μl三蒸水 33?25μl模板cDNA 5μl蓋緊蓋子，離心數(shù)秒后置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR循環(huán)為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s、55℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min， 30個(gè)循環(huán)，最后72?C延伸7 min。,細(xì)胞裂解,RNA釋

19、放,cDNA,PCR擴(kuò)增,逆轉(zhuǎn)錄酶,耐熱DNA聚合酶,,RT-PCR擴(kuò)增,,,,,,,,,,,,,,,,,引物dNTPs二價(jià)金屬離子DNA聚合酶,引物dNTPs二價(jià)金屬離子逆轉(zhuǎn)錄酶,RT-PCR過程,逆轉(zhuǎn)錄酶/耐熱DNA聚合酶,RT-PCR的應(yīng)用(application),獲得基因完整編碼區(qū)序列檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物半定量比較不同樣品間mRNA水平制備用于雜交的cDNA探針,PCR技術(shù)在臨床應(yīng)用中的問題和對(duì)策,在我國，前一

20、個(gè)時(shí)期PCR應(yīng)用相當(dāng)混亂。從技術(shù)因素分析，常規(guī)PCR作為臨床檢驗(yàn)技術(shù)存在的最主要的問題是，擴(kuò)增產(chǎn)物污染帶來的假陽性。常規(guī)PCR只能定性不能定量，也影響了評(píng)價(jià)PCR檢測(cè)結(jié)果的臨床診斷意義。定量是PCR作為臨床檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展的另一個(gè)重要目標(biāo)。,瓊脂糖凝膠電泳基本原理,瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖作為固體支持物的一種電泳方法。因?yàn)楦鞣N核酸分子的電荷及質(zhì)量之比是相近的，在沒有支持物的電場(chǎng)中，它們以相同的速度前進(jìn)。瓊脂糖凝膠電泳具有分子篩效應(yīng)

21、，所以在適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠中電泳，線性DNA分子在電場(chǎng)中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)成反比，從而達(dá)到分離的目的。,瓊脂糖凝膠電泳（Agarose Gel Electrophoresis）分離的原理,使 TAE浸過凝膠表面在陰極的加樣孔加樣（紅正黑負(fù)）分子篩作用分子量越小，遷移速度越快,瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍Separation Range Vs. % Agarose,瓊脂糖凝膠濃度與分離效率,,,大片段在 0.7%瓊脂

22、糖凝膠中分離效果好,小片段在 1.5%瓊脂糖凝膠中分離效果好,上樣,上樣緩沖液甘油可增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便EDTA, SDS 可滅活限制性內(nèi)切酶,溴化乙錠( EB)染色,EB堆砌在DNA雙螺旋的堿基對(duì)之間,DNA 分子越小,結(jié)合的EB 越少,染色越淡,溴化乙錠是一種熒光染料,可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激

23、發(fā)下，發(fā)出紅色熒光，常用 0.5mg/ml,+,+,,注意事項(xiàng),一定要等凝膠冷卻至60℃時(shí)再入加溴化乙錠切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)(靠近加樣 孔的一端為負(fù)) 加完樣品后最好先觀察一段時(shí)間插電極或拔電極時(shí)必須將儀器電源關(guān)掉不要使樣品跑出凝膠,瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用,PCR產(chǎn)物鑒定酶切片段鑒定DNA片段回收DNA的定量,分子克隆(molecular cloning)基因工程的核心,克隆：克隆是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親

24、 代完全相同的子代群體,分子克隆,細(xì)胞克隆,動(dòng)物克隆,基因工程中所指的克隆，是在體外對(duì)DNA分子按照既定目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入合適細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA分子得大量拷貝。這類克隆是在分子水平上操作的，故稱為分子克隆。又被稱為基因克隆或DNA克隆。,分子克隆中常用的工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶堿性磷酸酶核酸外切酶,基因克隆的基本程序,外源基因或

25、目的基因的獲得載體的構(gòu)建或選擇連接轉(zhuǎn)化陽性重組體的篩選與鑒定,目的基因,目的基因是指我們所要研究和應(yīng)用的基因，也就是我們將要克隆或表達(dá)的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中的第一步。體外擴(kuò)增基因法(PCR and RT-PCR) 人工合成基因法限制性內(nèi)切酶直接分離法獲得基因文庫篩選法從cDNA文庫中篩選,RT-PCR,RNA 提取RT-PCR,Extract RNA from virus/cells,RNA,載

26、體(Vector),載體是指能夠攜帶外源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增或誘導(dǎo)外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的工具。,載體應(yīng)具備的條件,帶有復(fù)制子多克隆酶切位點(diǎn)篩選標(biāo)志完整的轉(zhuǎn)錄單位（表達(dá)型載體）,載體的分類,按功能分類：克隆載體和表達(dá)載體按受體細(xì)胞分類：原核細(xì)胞載體和真核細(xì)胞載體按載體來源分類：質(zhì)粒載體、嗜菌體、病毒、酵母人工染色體、粘粒,pGEM-T Easy Vector,綠色熒光蛋白載體,酶切載體和目的基因(Enzyme rest

27、riction digest of DNA plasmid vector and target gene）,目的基因與載體的連接（ligation）,利用DNA連接酶把載體DNA和要克隆的目的DNA片段連接在一起，成為一個(gè)完整的重組分子，被稱為連接反應(yīng)。,DNA 連接酶(DNA Ligase),催化兩個(gè)獨(dú)立的DNA片段5‘-磷酸基團(tuán)和3’-羥基基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵。,連接方法,粘性末端連接法：?jiǎn)蚊高B、雙酶連平齊末端連接法同聚物接尾

28、法人工接頭法PCR產(chǎn)物與載體的連接：限制性酶切位點(diǎn)添加法、T/A克隆法,單一酶切的粘性末端連接缺點(diǎn),載體自連：載體DNA兩端的粘性末端可以自身退火成環(huán)，產(chǎn)生載體-載體相連接的假陽性克隆。雙向插入：由于使用同一種內(nèi)切酶，載體與插入片段的4個(gè)末端全為相同的粘性互補(bǔ)順序，所以目的基因插入可以有兩個(gè)方向。,,,Bam HⅠ切割反應(yīng),T4 DNA連接酶 15ºC,,,同一限制酶切位點(diǎn)連接,不同限制酶切位點(diǎn)的連接（雙酶連）,Eco

29、 RⅠ切割位點(diǎn),Bg lⅡ切割位點(diǎn),平端連接,適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端,同聚物加尾連接,在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。,人工接頭(linker)連接,在平端加上酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。,T/A克隆法,利用含有單個(gè)胸腺嘧啶（T）3‘-突出末端的線性化載體

30、與帶有單個(gè)腺苷酸（A）3‘-突出末端的PCR產(chǎn)物來進(jìn)行克隆，這種方法被稱為T/A克隆法。此方法利用了Taq DNA聚合酶具有延伸酶的活性，即不依賴模板的方式將一個(gè)核苷酸添加到已完成延伸的PCR產(chǎn)物的3‘-末端。在四種核苷酸都存在的情況下，這個(gè)添加上去的核苷酸通常是A殘基。,重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞,外源DNA分子與載體組成重組分子后，需要導(dǎo)入受體細(xì)胞才能進(jìn)行繁殖和表達(dá)，受體細(xì)胞系指被導(dǎo)入重組分子的細(xì)胞，又稱宿主細(xì)胞。根據(jù)導(dǎo)入受體細(xì)胞的方式

31、不同，可分為：轉(zhuǎn)化（transformation）：將重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過程轉(zhuǎn)染（transfection）：將重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程感染（infection）：噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖的過程,轉(zhuǎn)化過程,制備感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）：用物理或化學(xué)方法處理細(xì)胞，使其處于最適攝取和容忍外來DNA的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。將重組DNA分子和感受態(tài)細(xì)胞相混合，使DNA分子

32、進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有抗生素的瓊脂平板上生長(zhǎng),氯化鈣法原理,細(xì)菌處于0℃氯化鈣低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基鳥磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42 ℃短時(shí)間熱休克處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可篩選出所需的轉(zhuǎn)化子。,氯化鈣法(Chemical transformation with

33、 Calcium Chloride ),CaCl2方法的轉(zhuǎn)化效率一般可達(dá)106-107轉(zhuǎn)化子/μg DNA。關(guān)鍵是(1)使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌 (2)低溫操作 (3)手法溫柔優(yōu)點(diǎn): 簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可重復(fù)性高。缺點(diǎn): 轉(zhuǎn)化效率稍低，而且不能轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒(＞15Kb),電轉(zhuǎn)法(Transformation by Electroporation),重組DNA的篩選與鑒定,抗藥性篩選法藍(lán)白篩選法DNA限制性內(nèi)切酶圖譜

34、分析DNA序列測(cè)定法核酸雜交法PCR法,抗生素篩選轉(zhuǎn)化結(jié)果,Growth on agar plates (Amp+X-Gal) and selection for antibiotic resistant colonies,,重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為,小 結(jié),重組DNA技術(shù)操作的主要步驟,克隆常見問題,轉(zhuǎn)化后無克隆產(chǎn)生白色菌落很少或者根本沒有實(shí)驗(yàn)組只有白色菌落白色菌落中陽性克隆率低,重組DNA的應(yīng)用,克隆基因

35、的表達(dá)探針標(biāo)記基因組序列分析基因的定點(diǎn)突變基因打靶技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù),質(zhì)粒提取及酶切鑒定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。,plasmid,chromosome,質(zhì)粒類型,質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型： 松弛型

36、質(zhì)粒和 嚴(yán)緊型質(zhì)粒1.松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid) 松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。2.嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringent plasmid) 嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制需要一個(gè)質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過用氯霉素等蛋白合成抑制劑來增加。按功能分為3類：F質(zhì)粒（即性質(zhì)粒） R質(zhì)粒（即抗藥性質(zhì)粒） C

37、ol質(zhì)粒（即大腸桿菌素因子）,質(zhì)粒DNA的一般性質(zhì),環(huán)狀超螺旋DNA分子質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的復(fù)制依賴宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)器質(zhì)粒有相容性及不相容性質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是比病毒更簡(jiǎn)單的原始生命。,Target Genes Carried by Plasmid,1 plasmid1 cell,Recombinant PlasmidTransformation,Target GeneRecombinatio

38、n,RestrictionEnzyme,RestrictionEnzyme,Chromosomal DNA,Target Genes,DNA Recombination,Transformation,Host Cells,,,Juang RH (2004) BCbasics,質(zhì)粒的應(yīng)用,大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要

39、媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。,質(zhì)粒載體(plasmid vectors),是一獨(dú)立的復(fù)制子有篩選標(biāo)記具有酶切位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)分子量小，拷貝數(shù)高測(cè)序、亞克隆、表達(dá)、可重復(fù)性高,分離質(zhì)粒DNA方法,從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的有：堿變性法； 煮沸法； SDS法；羥基磷灰石層析法等各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收

40、得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。,質(zhì)粒DNA提取的步驟,所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；DNA分離質(zhì)粒DNA；,培養(yǎng)單克隆細(xì)胞,Amplification and Screening of Target Gene,,,,,1,1 cell line, 1 colony,X100,X1,000,PlasmidDuplication,Bacteria Duplica

41、tion,Plating,Pick the colonycontaining target gene,,=100,000,,Juang RH (2004) BCbasics,堿變性法基本原理,在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)

42、粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。,質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備的問題與對(duì)策,質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這是由于：從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA 。DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)。重新沉淀

43、DNA，讓酒精充分揮發(fā)。DNA中殘留有金屬離子，可增加70%乙醇洗滌的次數(shù)。出現(xiàn)無質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象，這可能是由于細(xì)菌中無質(zhì)?；蚝怂岢恋眍w粒已同乙醇一起被棄去,重組質(zhì)粒的鑒定,瓊脂糖凝膠電泳限制性內(nèi)切酶酶切紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA自動(dòng)測(cè)序核酸雜交法PCR法,質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳(Agarose Gel Electrophoresis),在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移取決于DNA分子本身的大小和構(gòu)型。相對(duì)分子質(zhì)量不同的

44、DNA片段泳動(dòng)速度不一樣。質(zhì)粒DNA的形態(tài)不一，電泳時(shí)在凝膠中的遷移率不同。因此，凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。超螺旋的質(zhì)粒DNA一般遷移最快、開環(huán)（缺口）質(zhì)粒DNA遷移最慢，線化DNA位于兩者之間。,質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳,限制性核酸內(nèi)切酶,1970年發(fā)現(xiàn)的，是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定堿基順序的核酸水解酶。被稱為分子生物學(xué)的“手術(shù)刀”。有三種類型的限制性

45、內(nèi)切酶，最常用的是Ⅱ型識(shí)別順序一般為4-6個(gè)堿基的回文結(jié)構(gòu)。如下：,Palindrome, Restriction Enzyme, Sticky Ends,,,Sticky Ends(Cohesive Ends),,EcoRI,,Juang RH (2004) BCbasics,限制性內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口,平頭末端(blunt end)5’端突出的粘性末端3’端突出的粘性末端,平頭末端(blunt end),在

46、識(shí)別順序的對(duì)稱軸上，對(duì)雙鏈DNA同時(shí)切割，產(chǎn)生平頭末端(blunt end) 5’-GG CC-3’ HaeⅢ 5’-GG CC-3’ 3’-CC GG-5’ 3’-CC GG-5’,,,,5’端突出的粘性末端,在識(shí)別順序的兩個(gè)對(duì)稱點(diǎn)切開DNA雙鏈，產(chǎn)生帶單鏈尾巴的粘性末端,從5’端切割產(chǎn)生5’端突出的粘性末端5’-G AATTC-3’

47、 EcoRⅠ5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’ 3’-CTTAA G-5’,,,,3’端突出的粘性末端,在識(shí)別順序的兩個(gè)對(duì)稱點(diǎn)切開DNA雙鏈，產(chǎn)生帶單鏈尾巴的粘性末端,從3’端切割產(chǎn)生3’端突出的粘性末端 5’-CTGCA G-3’ PstⅠ 5’-CTGCA G-3’ 3’-G ACGT

48、C-5’ 3’-G ACGTC-5’,,,,用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒,質(zhì)粒 4ul去離子水 4ul10xbuffer 1ulEcoRⅠ 0.5ul離心混合后，37℃ 1小時(shí),酶切反應(yīng)注意事項(xiàng),決不能用水稀釋,以免變性失活。預(yù)先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立即放于冰上。分裝小份避

49、免反復(fù)凍融。使用無菌的新吸頭。少加水,使體積最小,但保證酶液體積不超過總體積的10％,否則酶液中的甘油會(huì)抑制酶活性。,限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用,改造及組建質(zhì)粒組建基因組DNA物理圖譜基因組DNA同源性研究DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與順序分析,測(cè)序技術(shù)進(jìn)展同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳,多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳,單色熒光標(biāo)記平板電泳,同位素標(biāo)記平板電泳,,A,C,G,T,,,,,,測(cè)序圖譜,T A T

50、TG CAT TG TC TGCATTG T C T,,,,Dideoxynucleotides,,Phosphodiesterbond,3’,5’,dideoxynuceotide,Terminated,ddNTP,Sanger’s Method: How Terminated,Normal Linking,Can not react,,Juang RH (2004) BCbasics,The ddATP Reaction,5’TT

51、ATCG,3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’,5’TTATCGTA,5’TTATCGTACCATGA,5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA,5’TTATCGTACCATGACTAGA,DNA自動(dòng)測(cè)序,DNA自動(dòng)測(cè)序是在Sanger法的基礎(chǔ)上經(jīng)過加工改進(jìn)的。將2‘,3’-雙脫氧三磷酸核苷酸(ddNTP)用不同的熒光標(biāo)記，如用紅色熒光標(biāo)記ddTTP，藍(lán)色熒光標(biāo)記ddCTP，黃色熒光標(biāo)記ddG

52、TP，綠色熒光標(biāo)記ddATP。在測(cè)序PCR反應(yīng)中，將熒光標(biāo)記的ddNTP摻入到反應(yīng)中，當(dāng)某一ddNTP分子摻入到合成的DNA分子中時(shí)，該鏈延伸終止并且標(biāo)記上相應(yīng)的熒光染料分子。反應(yīng)終止后，就會(huì)得到不同熒光標(biāo)記的長(zhǎng)短不同的DNA分子。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電泳分離后，用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)，收集的信號(hào)經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析后便可以得到DNA的核苷酸序列。,測(cè)序反應(yīng) (20μl),模板(template)：200-500ng引物(prime

53、r)：5pmolPremix(ddNTP, dNTP, Taq Polymerase): 8μlH2O95℃20 s, 50℃15 s, 60℃ 1min, 25 cycles,原始數(shù)據(jù)分析,除文本文件外，DNA自動(dòng)測(cè)序還提供測(cè)序圖數(shù)據(jù)讀取軟件可以對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到最終的測(cè)序結(jié)果,,,測(cè)序結(jié)果分析,影響測(cè)序結(jié)果的因素,DNA自動(dòng)測(cè)序在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用,基因組研究疾病診斷基因分型,分子生物學(xué)中使用的雜交方法,核酸分子雜交原理

54、,核酸分子雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的基本技術(shù)之一,其基本原理就是應(yīng)用核酸鏈中堿基互補(bǔ)的原理（A-T，C-G），用已知的核酸（探針），通過雜交來檢測(cè)樣本中與探針同源的核酸序列。根據(jù)雜交對(duì)象的不同可以分為DNA（模板）/DNA或RNA（探針）的雜交即Southern blotting ；RNA（模板）/DNA或RNA（探針）雜交即Northern blotting。,核酸分子雜交的必要條件,固相載體（液相雜交除外），常用的有硝酸纖

55、維素膜、尼龍膜、玻片、聚苯乙烯等。帶示蹤物標(biāo)記的探針，常用的有放射性同位素、地高辛（Digoxigenin-11-dUTP)、生物素（Biotin）等。經(jīng)變性處理的待檢模板。合適的雜交條件。示蹤物檢測(cè)系統(tǒng)。,探針標(biāo)記,缺口移位法（缺口平移、缺口翻譯）末端標(biāo)記法PCR摻入法,探針和模板的單鏈化,加熱變性堿變性,標(biāo)記示蹤物的檢測(cè),放射性同位素的檢測(cè)：感光膠片地高辛檢測(cè)：(Anti-Dig)Antibody-AP，底物為BCI

56、P+NBT生物素檢測(cè)：Biotin-Streptavidin-AP,BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽NBT；氯化四唑硝基藍(lán)（氯化四唑氮藍(lán)）,標(biāo)本,源于病人：血清/血漿等源于細(xì)胞：基因組源于培養(yǎng)物：細(xì)菌、病毒等重組質(zhì)粒核酸擴(kuò)增產(chǎn)物其它,Southern / Northern Blotting (Hybridization),,,,Removeunboundprobe,intact RNA or digested

57、 DNA,Hybridization,探針模板雜交,地高辛標(biāo)記法原理,將地高辛連接于dUTP第五位的嘌呤環(huán)上，形成Dig- dUTP。DNA通過地高辛配基標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（ dUTP）隨機(jī)插入結(jié)合而被標(biāo)記。雜交的靶DNA通過酶聯(lián)免疫法與一個(gè)抗體復(fù)合物結(jié)合，接著在BCIP/NBT存在下，由酶催化反應(yīng)，在雜交部位顯色。,DIG標(biāo)記探針的Southern blotting過程示意圖,雜交探針的標(biāo)記：地高辛系統(tǒng)標(biāo)記

58、 digoxigenin DIG dUTP-連接臂-甾醇半抗原 抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物,斑點(diǎn)雜交試驗(yàn),bDNA技術(shù),,,,Sample DNA,Each spot contains known DNA,Biochip,Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31,Com

59、plementary DNA hybridize,Signal appears,Biochip Based on Hybridization,Juang RH (2004) BCbasics,Southern blot 應(yīng)用,克隆基因的酶切圖譜分析基因組基因的定性及定量分析基因突變分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析,細(xì)胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)，它是研究基因表達(dá)調(diào)控，突變分析等的常規(guī)工具，隨著功能

60、研究的興起，其應(yīng)用越來越廣泛。,傳統(tǒng)方法,轉(zhuǎn)染技術(shù)Transfection,,細(xì)胞轉(zhuǎn)染分類,瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體中或形成附加體。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。,細(xì)胞

61、轉(zhuǎn)染(Transfection)及報(bào)告基因表達(dá)的檢測(cè)原理,目的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，對(duì)目的蛋白的表達(dá)及功能的研究可通過檢測(cè)特定報(bào)告基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。常用的基因報(bào)告系統(tǒng)有熒光蛋白報(bào)告系統(tǒng)、半乳糖苷酶報(bào)告系統(tǒng)、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。綠色熒光蛋白(GFP)在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下可發(fā)射綠色熒光的特性使得我們?cè)谵D(zhuǎn)染細(xì)胞后，無需對(duì)細(xì)胞作特殊的處理，只需觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的產(chǎn)生情況，就可了解轉(zhuǎn)染效率。,轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定,熒光顯微鏡觀察GFP（green fluo

62、rescent protein),存在于水母和珊瑚等腔腸動(dòng)物內(nèi)的生物發(fā)光蛋白，當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，GFP發(fā)射綠色熒光將綠色熒光蛋白表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不同類型的細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，可以比較不同細(xì)胞間轉(zhuǎn)染效率的差異，記錄表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞數(shù)的百分比，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。Western-blot 鑒定RT-PCRSouthern-blot 鑒定,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果,影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素,細(xì)胞培養(yǎng)物血清載體構(gòu)建DNA質(zhì)量轉(zhuǎn)染技術(shù)

63、,細(xì)胞培養(yǎng)物,健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度，一般推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將細(xì)胞傳代，這樣可提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能。另外一定要避免細(xì)菌、支原體或真菌的污染。,血清,大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。通常血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。因此在轉(zhuǎn)染前建議先

64、測(cè)試出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好的血清批號(hào)，轉(zhuǎn)染時(shí)用同一批號(hào)的血清，并同時(shí)做負(fù)對(duì)照（不加轉(zhuǎn)染試劑及外源DNA）以測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。,載體構(gòu)建,轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA、RNA、PCR產(chǎn)物、寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要

65、求特定的細(xì)胞周期，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，超螺旋質(zhì)粒DNA效率最高，線性DNA導(dǎo)入效率不如超螺旋DNA，但整合到染色體效率較高。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行，因此選擇組成及合適的啟動(dòng)子也很重要，同時(shí)做空載體及其它基因相同載體構(gòu)建的正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。,DNA質(zhì)量,DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原