人CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制.pdf

1、CD133是一種局限性分布于胞漿膜突出處的5次跨膜糖蛋白,1997年由Yin等首次報(bào)道,2000年6月由國(guó)際白細(xì)胞分化抗原工作組會(huì)議(ILDAW)正式命名為CD133。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)人CD133分子是分離和鑒定多種干細(xì)胞(尤其是腫瘤干細(xì)胞)的表面標(biāo)記分子,也有研究表明CD133+腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖、自我更新和多向分化的潛能,對(duì)于CD133分子生物學(xué)特征和功能的研究有助于對(duì)腫瘤干細(xì)胞特征和功能的認(rèn)識(shí),同時(shí)在腫瘤的診斷治療以及預(yù)后判斷方

2、面具有重要價(jià)值,有望成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。雖然CD133分子從1997年發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直被廣大科研工作者關(guān)注,但迄今為止,由于與其相作用的配體分子仍然未知,對(duì)CD133分子尚缺乏有效的研究手段, CD133的生物學(xué)功能以及其參與的信號(hào)通路至今尚需要進(jìn)一步研究闡明。目前商品化的CD133抗體(W6C3B1, AC133, AC141, Miltenyi Biotec)由于主要是識(shí)別該分子的糖基化位點(diǎn),在運(yùn)用中有一定的局限性。鑒此,研制新型特異性

3、抗人CD133單克隆抗體將有助于拓展對(duì)CD133分子的研究,揭示CD133的生物學(xué)功能以及該分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制,不僅在理論研究中具有重要意義,而且在臨床應(yīng)用中也具有重要的潛在價(jià)值。本文旨在通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD133分子的L929基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,以L929/CD133和天然高表達(dá) CD133的結(jié)腸癌細(xì)胞株 HCT116為免疫原,常規(guī)免疫BALB/c小鼠,研制鼠抗人CD133單克隆抗體,初步探討CD133分子的生物學(xué)特性,近而為

4、研究該分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：人CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立。
　　目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD133分子的L929/CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,為研制鼠抗人CD133單克隆抗體提供免疫原和陽(yáng)性篩選細(xì)胞。
　　方法：將CD133全長(zhǎng)基因雙酶切后重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 pEGZ-Term。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將測(cè)序正確的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/CD133和兩個(gè)輔助

5、病毒載體pHIT456和pHIT60共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T;48h和72h后分別收集含有完整重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清感染L929細(xì)胞;72h后,用Zeocin進(jìn)行加壓,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)CD133分子的L929/CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD133的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD133。
　　結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人CD133的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,為研制鼠抗人CD

6、133單克隆抗體和研究CD133生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分：鼠抗人CD133單克隆抗體的研制。
　　目的：研制鼠抗人CD133單克隆抗體,探討該單抗的生物學(xué)特性,為進(jìn)一步研究人CD133分子的功能奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法：以穩(wěn)定表達(dá)人CD133的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD133和天然高表達(dá)CD133的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116為免疫原,免疫6~8周齡的BALB/c小鼠,采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),將免疫小鼠的脾

7、臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞 Ag8進(jìn)行細(xì)胞融合,并于HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng);以L929/CD133作為陽(yáng)性篩選細(xì)胞株,并以轉(zhuǎn)染pEGZ-Term空載體的L929/mock細(xì)胞株作為陰性對(duì)照,采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選;對(duì)所得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng),獲得1株持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人 CD133單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;利用細(xì)胞核染色技術(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、細(xì)胞免疫化學(xué)法等試驗(yàn),對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞株及單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)特

8、性的鑒定;采用間接免疫熒光法檢測(cè)分析所獲單抗對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株和腫瘤組織上CD133分子的識(shí)別。
　　結(jié)果：獲得l株穩(wěn)定持續(xù)分泌鼠抗人CD133單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為18E5。經(jīng)體外連續(xù)培養(yǎng)半年以上,液氮凍存后復(fù)蘇,細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好,分泌抗體的性能穩(wěn)定。經(jīng)快速定性試紙分析鑒定,18E5的重鏈為 IgG2b,輕鏈為κ鏈;單抗識(shí)別位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明18E5與商品化單抗AC133和AC141識(shí)別表位不同,腹水形成陽(yáng)性率為10

9、0％,腹水的收獲量平均為4ml/只。間接免疫熒光分析結(jié)果顯示:單抗18E5能夠特異性識(shí)別人CD133分子,并且能夠識(shí)別人白血病細(xì)胞株U937、肺癌細(xì)胞株A549、NCI-H1299,結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、Caco-2、HCT116以及胰腺癌細(xì)胞株P(guān)atu-8988表面CD133分子的表達(dá),也可識(shí)別肺癌和結(jié)腸癌標(biāo)本中CD133分子的表達(dá)。
　　結(jié)論：成功獲得 l株穩(wěn)定持續(xù)分泌鼠抗人 CD133單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,其分泌的抗體