小鼠B7-H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和單克隆抗體的研制及其對(duì)T細(xì)胞的共刺激效應(yīng).pdf

1、T細(xì)胞的活化除了需要通過(guò)APC遞呈MHC-抗原肽給抗原特異性T細(xì)胞提供第一信號(hào)外，還需要表達(dá)于免疫細(xì)胞表面一系列共刺激分子提供第二信號(hào)。如果缺少第二信號(hào)，將會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的無(wú)反應(yīng)性或免疫耐受。共刺激分子的協(xié)同加強(qiáng)或負(fù)性調(diào)節(jié)在機(jī)體免疫應(yīng)答的整個(gè)過(guò)程中起著及其重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 小鼠B7-H3屬B7超家族新成員。迄今B7-H3的生物學(xué)特性和功能研究尚待深入并存在爭(zhēng)議。目前的研究認(rèn)為，B7-H3在介導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答中存在2種截然不同

2、的作用：協(xié)同刺激或抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外一些研究提出B7-H3分子可以作為腫瘤如肺癌，前列腺癌以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的表面標(biāo)記分子具有診斷和干預(yù)靶向價(jià)值。進(jìn)而鑒于B7-H3受體尚未得到最終確認(rèn)，這也是B7-H3研究中存在的最大困難。
　　 本研究旨在通過(guò)建立小鼠B7-H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，研制特異性單克隆抗體和融合蛋白，從不同角度探討B(tài)7-H3的生物學(xué)功能。
　　 本論文分為兩個(gè)部分：
　　 一、小鼠B7-H3基因

3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞株及其單克隆抗體的研制
　　 1.采用RT-PCR的方法從小鼠骨髓來(lái)源的DC中擴(kuò)增出小鼠B7-H3編碼區(qū)全長(zhǎng)基因。經(jīng)雙酶切后插入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，構(gòu)建成重組載體pIRES2-EGFP/B7-H3。通過(guò)脂質(zhì)體法將測(cè)序正確的重組載體pIRES2-EGFP/B7-H3轉(zhuǎn)染293和CHO細(xì)胞，G418加壓篩選并經(jīng)過(guò)數(shù)次亞克隆。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示B7-H3基因同時(shí)轉(zhuǎn)染的293和CHO細(xì)胞膜上能穩(wěn)定高表達(dá)小鼠B7

4、-H3分子。為研制小鼠B7-H3單克隆抗體提供了有效的免疫原。2.以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株293/B7-H3為免疫原，免疫SD大鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫大鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。以CHO/B7-H3為陽(yáng)性篩選細(xì)胞，CHO/mock細(xì)胞作陰性對(duì)照，F(xiàn)CM分析篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)亞克隆化培養(yǎng)，最終獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌大鼠抗小鼠B7-H3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（18F9和19F

5、6）。經(jīng)熒光微球法鑒定，兩株單抗重鏈均為IgG2b，輕鏈為κ鏈。Western blot及流式細(xì)胞分析均顯示，兩株單抗都能與B7-H3分子特異性結(jié)合，且兩株單抗識(shí)別不同的抗原表位。體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和液氮凍存后，復(fù)蘇的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，穩(wěn)定分泌抗體。研究發(fā)現(xiàn)小鼠B7-H3在B細(xì)胞、單核細(xì)胞和DC細(xì)胞上組成性表達(dá)，在靜息和活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞上不表達(dá)。小鼠B7-H3蛋白表達(dá)在膀胱上皮細(xì)胞胞漿和膜上，而在其他正常組織幾乎都不表達(dá)。由此表明

6、，所研制的單克隆抗體能運(yùn)用于流式熒光標(biāo)記，免疫印跡及免疫組化，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　 二、小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)活性的研究
　　 通過(guò)重疊POR技術(shù)將小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重鏈Fc恒定區(qū)基因拼接，按照構(gòu)建B7-H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法將重組基因轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)篩選并獲得CHO/mB7-H3-Fc轉(zhuǎn)染細(xì)胞。該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)后，收集細(xì)胞上清、超濾濃縮后行Protein G柱純化，

7、獲得純品B7-H3-Fc融合蛋白，經(jīng)Western blot鑒定。通過(guò)CCK-8和ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該融合蛋白對(duì)T淋巴細(xì)胞的體外增殖和細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ的分泌具有明顯的促進(jìn)作用。在T細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)中，單抗的加入可部分阻斷T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。該融合蛋白識(shí)別T細(xì)胞上的受體，而與構(gòu)建的TLT2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株不結(jié)合，提示B7-H3的受體可能不是TLT2分子。同時(shí)也表明所研制的單抗具有阻斷功能。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建

8、了基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株293/B7-H3和CHO/B7-H3；研制2株特異性大鼠抗小鼠B7-H3功能性單克隆抗體和mB7-H3-Fc融合蛋白基因。該融合蛋白能夠促進(jìn)T細(xì)胞體外增殖及分泌IL-2，IFN-γ。T細(xì)胞體外增殖試驗(yàn)顯示，單抗18F9對(duì)B7-H3介導(dǎo)的刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子具有阻斷作用。研究也證實(shí)TLT2分子不是小鼠B7-H3的受體。B7-H3作為重要的共刺激分子，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮了正性共刺激作用。總之，上述結(jié)果為深入研究B