鼠抗人CXCR4單克隆抗體的研制及其對腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞生物學(xué)作用的研究.pdf

1、CXCR4/SDF-1α是目前最受關(guān)注的一對趨化因子配體和受體，相關(guān)研究揭示它們參與了細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化和增殖等多種生理功能，并在多種病理過程中發(fā)揮重要作用。CXCR4/SDF—1α為人們廣為熟知的生物學(xué)功能是在炎癥反應(yīng)中趨化各種炎癥細(xì)胞到損傷部位，參與了炎癥細(xì)胞的滾動(dòng)、黏附和跨內(nèi)皮遷移等一系列過程。許多研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥細(xì)胞浸潤有著相似的形成過程，如均涉及到細(xì)胞滾動(dòng)、黏附和跨內(nèi)皮遷移等。也有研究報(bào)道，腫瘤細(xì)胞可以限定性表達(dá)某

2、些趨化因子或趨化因子受體，并且存在趨化因子信號途徑異常的狀態(tài)，提示趨化因子或其受體可能通過與炎癥細(xì)胞浸潤相似的機(jī)制參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。目前CXCR4/SDF—1α參與多種腫瘤如乳腺癌、肺癌、前列腺癌的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散已見報(bào)道。
　　 近來的還研究發(fā)現(xiàn)，在有效的免疫應(yīng)答中，SDF—1α不僅能趨化T細(xì)胞到次級淋巴器官，而且對T細(xì)胞的活化還具有協(xié)同刺激作用。Nanki研究發(fā)現(xiàn)，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量的記憶性CD4+T的集聚，其細(xì)胞表面

3、CXCR4的表達(dá)水平大大提高，關(guān)節(jié)腔內(nèi)SDF—1α表達(dá)水平也大大提高，推測CXCR4/SDF—1α的相互作用可能既可以聚集T細(xì)胞，而且為可T細(xì)胞活化提供一個(gè)潛在的協(xié)同刺激信號。
　　 盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CXCR4/SDF—1α有多種不同的生物學(xué)功能，并且推測它在行使不同的功能時(shí)依靠不同的的信號途徑。但是這些功能的的作用機(jī)制，信號傳導(dǎo)差異以及影響因素還需要進(jìn)一步深入研究。
　　 本研究旨在通過CXCR4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株作為免疫

4、原免疫小鼠研制獲得鼠抗人CXCR4單克隆抗體，并以抗人CXCR4單抗為材料研究揭示人CXCR4/SDF—1α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞上表達(dá)的生物學(xué)意義和對T細(xì)胞的協(xié)同刺激作用。
　　 一、鼠抗人CXCR4單克隆抗體的研制及生物學(xué)特性的鑒定
　　 [目的]研制鼠抗人CXCR4單克隆抗體，為探討人CXCR4/SDF—1α的生物學(xué)功能及其機(jī)制提供必備的物質(zhì)手段。
　　 [方法]利用高表達(dá)人CXCR4分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/C

5、XCR4為免疫原，常規(guī)免疫BALB/C小鼠。采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤融合技術(shù)研制鼠抗人CXCR4單克隆抗體，并以該基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CXCR4作為陽性篩選細(xì)胞，以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的對照細(xì)胞L929/Mock作為陰性篩選細(xì)胞。經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析、反復(fù)篩選和多次克隆化培養(yǎng)，獲得特異分泌鼠抗人CXCR4分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；采用細(xì)胞核染色體計(jì)數(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、競爭結(jié)合抑制以及Westernblot等試驗(yàn)，對獲得的雜交

6、瘤細(xì)胞株及單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定；用間接免疫熒光法初步分析單抗對免疫細(xì)胞表達(dá)CXCR4的識別作用。
　　 [結(jié)果]成功獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CXCR4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6H7和7D4。核型分析顯示，雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)目在100條以上，超過小鼠B細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)，表明為融合體；經(jīng)過快速定性試紙分析顯示，2株單抗輕鏈均為κ鏈，6H7重鏈為IgG1亞類，而7D7重鏈為IgG2a；Wes

7、ternblot分析結(jié)果顯示，單抗7D4能與CXCR4分子特異性結(jié)合，形成陽性條帶；單抗識別的抗原表位分析結(jié)果表明，單抗6H7和7D4與商品化的鼠抗人CXCR4單抗(克隆號12G5)識別不同的抗原表位。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，單抗6H7和7D4能檢測到PBMCs亞群上CXCR4分子的表達(dá)。
　　 [結(jié)論]成功獲得兩株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CXCR4單抗的雜交瘤細(xì)胞株，兩株單抗識別的抗原位點(diǎn)不同，與商品化單抗12G5識別的抗原位點(diǎn)也

8、不同，是兩株新型的抗人CXCR4單克隆抗體。這兩株抗人CXCR4單抗的研制成功為探討CXCR4表達(dá)特性、CXCR4/SDF—1α多種生物學(xué)功能及其機(jī)制提供必備的物質(zhì)手段。
　　 二、CXCR4/SDF—1α信號促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和增殖及其單抗阻斷作用的研究
　　 [目的]利用研制的CXCR4單抗，初步分析了CXCR4在多種腫瘤細(xì)胞株和膠質(zhì)瘤組織上的表達(dá)，以及探討了CXCR4/SDF—1α介導(dǎo)信號在單抗阻斷和非阻斷情況下對

9、膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251體外生物物學(xué)行為的影響。
　　 [方法]采用間接免疫熒光標(biāo)記法分析腫瘤細(xì)胞株表面CXCR4分子的表達(dá)，用免疫組織化學(xué)法檢測膠質(zhì)瘤組織中CXCR4的表達(dá)。MTT法研究了SDF—1α刺激的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251體外增殖及單抗7D4的阻斷作用。用趨化小室分析了CXCR4/SDF—1α信號對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的體外遷移作用及單抗的阻斷作用。
　　 [結(jié)果]流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，顯示大多數(shù)腫瘤細(xì)胞株上都表達(dá)CXCR

10、4分子，尤其是造血系統(tǒng)來源的腫瘤細(xì)胞株CXCR4表達(dá)較高，而在上皮源性的腫瘤細(xì)胞株M231、MCF—7和95D上表達(dá)相對偏低。免疫組化的結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤組織上檢測到CXCR4的表達(dá)。增殖與抗體阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SDF—1α能夠刺激U251體外增殖，并且有濃度依賴性；CXCR4特異性的單抗7D4能阻斷SDF—1α的這一激發(fā)作用。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單抗7D4也能阻斷SDF—1α誘導(dǎo)的U251細(xì)胞的體外遷移作用，表明研制的抗人CXCR4單抗7D

11、4具有阻斷作用。
　　 [結(jié)論]本研究分析并證實(shí)了CXCR4在腫瘤細(xì)胞株表面的廣泛表達(dá)和在膠質(zhì)瘤組織上表達(dá)；CXCR4/SDF—1α信號能夠作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的體外生長和轉(zhuǎn)移，推測該信號與膠質(zhì)瘤侵襲性生長有關(guān)。
　　 三、CXCR4/SDF—1α信號對T細(xì)胞協(xié)同刺激及其單抗阻斷作用的研究
　　 [目的]利用所獲得的抗人CXCR4單克隆抗體7D4和重組人SDF—1α，探討CXCR4/SDF—1α相互作用對T細(xì)胞協(xié)同

12、刺激作用。
　　 [方法]采用熒光單標(biāo)或雙標(biāo)記法通過流式細(xì)胞術(shù)分析DC誘導(dǎo)成熟過程中細(xì)胞表面及PHA活化的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞上的CXCR4的表達(dá)；用激發(fā)型抗人CD3單抗包板，重組人SDF—1α聯(lián)合或不聯(lián)合抗人CD28單抗處理，通過流式細(xì)胞術(shù)、MTT法和ELISA法分別測定了SDF—1α對T淋巴細(xì)胞活化、增殖及細(xì)胞因子分泌的作用；在此基礎(chǔ)上，用激發(fā)型抗人CD3單抗包板，選用特定的SDF—1α濃度和CD28單抗聯(lián)合處理，通

13、過流式細(xì)胞術(shù)、MTT法和ELISA法分別測定單抗7D4對T淋巴細(xì)胞活化、增殖及細(xì)胞因子分泌的影響；
　　 [結(jié)果]PHA活化條件下，CD4+T細(xì)胞上CXCR4呈上調(diào)性表達(dá)，隨后表達(dá)有所下降。而在CD8+T細(xì)胞上沒有明顯的變化；CXCR4分子在單核細(xì)胞誘導(dǎo)至mDC過程中，呈現(xiàn)逐步上調(diào)性表達(dá)。SDF—1α單獨(dú)作用時(shí)，并不能明顯促進(jìn)T細(xì)胞的體外增殖、活化和上調(diào)細(xì)胞因子的分泌，而與CD28信號協(xié)同作用時(shí)，SDF—1α則能促進(jìn)T細(xì)胞的增殖

14、和細(xì)胞因子的分泌，并且有一定的劑量依賴性。但是，對T細(xì)胞上CD25和CD69的表達(dá)無顯著影響。單抗7D4可阻斷SDF—1α對T細(xì)胞的協(xié)同刺激作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。而且單抗7D4能不同程度地下調(diào)CD4+T細(xì)胞上CD25和CD69的表達(dá)，但對CD8+T上的CD25和CD69影響并不明顯。
　　 [結(jié)論]以研制獲得的抗人CXCR4單抗7D4和重組人SDF—1α為手段，揭示了CXCR4在免疫細(xì)胞上的調(diào)節(jié)性表達(dá)。同時(shí)，CXCR4/

15、SDF—1α信號在與CD28信號共同作用時(shí)，對T細(xì)胞的活化具有協(xié)同刺激作用，單抗7D4能抑制SDF—1α的協(xié)同刺激作用。
　　 綜上所述，本研究成功獲得了兩株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CXCR4單抗的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)一步對單抗的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定。在此基礎(chǔ)上分析了PBMCs亞群上CXCR4的表達(dá)譜。通過對腫瘤表面CXCR4表達(dá)的檢測和在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株上的功能分析，證實(shí)了CXCR4是腫瘤組織中廣泛表達(dá)的分子，并且對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲