牛γ干擾素單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、IFN-γ(又稱免疫干擾素、Ⅱ型干擾素)是細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要介導(dǎo)者，在抗原或者非特異性有絲分裂原的刺激下主要由固有免疫系統(tǒng)的NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞，以及獲得性免疫應(yīng)答系統(tǒng)的CD8+和CD4+Th1效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌。IFN-γ具有抗病毒和胞內(nèi)感染、抗腫瘤和廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性等廣譜且復(fù)雜的生物學(xué)功能。
　　 IFN-γ在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，特別是防御胞內(nèi)菌感染的Th1型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和維持方面起著重要作用。分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)

2、是Th1型免疫應(yīng)答的特征性表現(xiàn)，通常把生物樣本中IFN-γ的水平、或者合成IFN-γ細(xì)胞總量作為進(jìn)行性Th1型免疫應(yīng)答的指示器。因而，定性或定量檢測(cè)生物樣本中IFN-γ的水平可以反映胞內(nèi)感染(比如分枝桿菌、李斯特菌、衣原體等病原感染)情況。
　　 高特異性的、與天然BoIFN-γ(bovineinterferon-gamma，牛γ干擾素)反應(yīng)的BoIFN-γ單克隆抗體可以作為配體純化天然BoIFN-γ和各種重組BoIFN-γ、作

3、為研究工具來研究牛IFN-γ生物學(xué)活性和體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用，或者依此建立各種免疫學(xué)檢測(cè)方法(如抗原捕獲ELISA、ELISPOT、Immuno-PCR、ICC等)來檢測(cè)生物樣本中BoIFN-γ的水平，從而評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)，以及診斷或輔助診斷疾病(如結(jié)核病、副結(jié)核病等)。為此本研究制備出了高特異性、與天然BoIFN-γ反應(yīng)的BoIFN-γ單克隆抗體，為上述研究奠定了最基本的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 以純化的rHis-BoIFN-γ為免疫

4、原免疫6周齡BALB/c小鼠，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，以rGST-BoIFN-γ為檢測(cè)原，用間接ELISA方法篩選陽性克隆，經(jīng)3次亞克隆后，共獲得30株穩(wěn)定分泌針對(duì)原核表達(dá)BoIFN-γ蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1B4、1D2、1D5、1E7、1G5、1H2、1H5、2B4、2B12、2D7、2D8、2E2、2E3、2G5、3A8、3A10、3C12、3E3、3E9、3F1、3F2、4C8、4D3、5B8、5F

5、5、6C7、6E8、7A6、7D10和7E5。
　　 亞類鑒定結(jié)果顯示1B4、1D2、1D5、1E7、1H2、2B12、2D7、2D8、2G5、3C12、3E3、3F1、3F2、4C8、4D3、5F5和6E817株單抗為IgG1，1G5、1H5、2B4、2E2、2E3、3A8、3A10、3E9、5B8、7A6和7E511株單抗為IgG2a，6C7和7D10兩株為IgG2b。間接ELISA測(cè)定效價(jià)結(jié)果顯示，除1H2和3F1上清效價(jià)

6、為1:1280，5B8為1:2560較低外，其他27株單抗上清效價(jià)均在1×104～8×104之間，30株單抗腹水效價(jià)均在2×106～1.6×107之間。
　　 在Westernblotting分析試驗(yàn)中，1B4、1D2、1E7、1G5、1H2、1H5、2B12、2D8、2E2、2E3、2G5、3E3、3E9、4D3、5B8和6C7等16株單抗均與23KDarHis-BoIFN-γ和43KDarGST-BoIFN-γ重組蛋白發(fā)生反

7、應(yīng)，出現(xiàn)特異性條帶。
　　 以BoIFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品為抗原的間接ELISA顯示，1B4、1D2、1E7、1G5、1H2、2B12和2D87株單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清OD值較低，近于陰性;1D5、1H5、2B4、2D7、2E2、2E3、2G5、3A8、3A10、3C12、3E3、3E9、3F1、3F2、4C8、4D3、5B8、5F5、6C7、6E8、7A6、7D10和7E523株均呈明顯的陽性反應(yīng)。
　　 特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，大部分

8、單抗與rHis-CerIFN-γ(cervusinterferon-gamma，梅花鹿γ干擾素)具有交叉反應(yīng)，除此之外，單抗只與BoIFN-γ發(fā)生反應(yīng)，30株單抗均不與原核表達(dá)的其他除rHis-CerIFN-γ以外的重組細(xì)胞因子及對(duì)照菌反應(yīng)。
　　 以重組桿狀病毒Bacmid-preBoIFN-γ轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，利用間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定30株單抗是否與桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)的rBac-BoIFN-γ反應(yīng)，結(jié)果顯示，1B4、1D

9、2、1E7、2B12、2D8、4D3、5B8、5F5和7D109株單抗未出現(xiàn)明顯熒光呈陰性反應(yīng);1D5、1G5、1H2、1H5、2B4、2D7、2E2、2E3、2G5、3A8、3A10、3C12、3E3、3E9、3F1、3F2、4C8、6C7、6E8、7A6和7E521株單抗在細(xì)胞膜上均有明顯特異性熒光，與rBac-BoIFN-γ呈陽性反應(yīng)。
　　 收集PWM刺激牛全血的含天然BoIFN-γ的血漿以阻斷ELISA(Inhibit

10、ionELISA)方法鑒定30株單抗，結(jié)果顯示，1G5、1H2、1H5、2E2、2E3、2G5、3E3、3E9、4D3、5B8和6C7等11株單抗在該項(xiàng)試驗(yàn)中抑制率在50％以上，最大抑制率依次為75.09％、79.10％、79.55％、71.35％、83.40％、84.76％、83.33％、76.10％、93.26％、74.90％和85.43％，具有與天然BoIFN-γ反應(yīng)的能力。
　　 此外，在以分泌型Flp-In-293-B

11、oIFN-γ-FLAG細(xì)胞系表達(dá)的rFLAG-BoIFN-γ為阻斷劑的阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)中，2G5、3E3和3E9三株單抗抑制率達(dá)到90％以上，最大抑制率分別為95.10％、91.64％和94.14％，與該細(xì)胞系表達(dá)的BoIFN-γ具有良好反應(yīng)性。
　　 終上所述，本研究獲得了30株分泌針對(duì)原核表達(dá)BoIFN-γ蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其中1G5、1H2、1H5、2E2、2E3、2G5、3E3、3E9、4D3、5B8和6C