抗異硫氰酸熒光素單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素，因其特殊的分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，F(xiàn)ITC常用作熒光標(biāo)記物對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子進(jìn)行標(biāo)記。尤其是基于FITC建立的FITC-抗FITC檢測系統(tǒng)，能夠有效地?cái)U(kuò)大抗原抗體反應(yīng)的敏感性。本實(shí)驗(yàn)采用直接標(biāo)記法制備出異硫氰酸熒光素人工完全抗原，并通過雜交瘤技術(shù)研制出高親和力、高特異性的雜交瘤細(xì)胞株，利用體內(nèi)誘生腹水技術(shù)制備出抗異硫氰酸熒

2、光素單克隆抗體，并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行了鑒定?？?FITC單克隆抗體的研制為高效、快速地對(duì)FITC標(biāo)記的蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子進(jìn)行檢測奠定了基礎(chǔ)。
　　1.異硫氰酸熒光素人工完全抗原的合成及鑒定
　　采用直接標(biāo)記的方法將 FITC分別與大分子偶聯(lián)載體牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）進(jìn)行偶聯(lián)，合成人工完全抗原 FITC-BSA和 FITC-OVA。通

3、過紫外吸收光譜法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和動(dòng)物免疫法對(duì)人工完全抗原的偶聯(lián)效果進(jìn)行鑒定。依照紫外吸收光譜結(jié)果計(jì)算出 FITC-BSA和 FITC-OVA的偶聯(lián)比分別為14:1和13:1；SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示：FITC-BSA和 FITC-OVA的條帶相對(duì)于載體蛋白 BSA和 OVA的條帶出現(xiàn)了明顯的拖尾現(xiàn)象，初步證明偶聯(lián)成功。動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：制備的 FITC-BSA能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答，多抗血

4、清效價(jià)均可達(dá)到1:12800，其中3號(hào)小鼠的半數(shù)抑制濃度 IC50可以達(dá)到4.25 ng/mL，表明合成的人工抗原具有良好的免疫原性。
　　2.異硫氰酸熒光素單克隆抗體的制備及鑒定
　　選取免疫效果最好的3號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，通過間接ELISA法和間接競爭 ELISA法篩選出兩株強(qiáng)陽性雜交瘤細(xì)胞株，分別將其命名為1F11和2A7，采用有限稀釋法分別對(duì)其進(jìn)行亞克隆，三輪亞克隆后篩選出細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)較高（1:3200）的2A7

5、雜交瘤細(xì)胞株，通過小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備抗 FITC單克隆抗體，通過正辛酸-硫酸銨法對(duì)收集到的單抗腹水進(jìn)行純化， SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示其僅在53 KD和25 KD處存在兩條明顯的特異性條帶，表明純度較高。經(jīng)鑒定，純化后的2A7單抗效價(jià)可以達(dá)到1:2.048×106，親和力常數(shù)為1.72×109 L/mol，對(duì)FITC的IC50為1.37μg/mL；根據(jù)鼠單抗亞型鑒定試劑盒測定其亞型為 IgG1、κ輕鏈型；特異性鑒定結(jié)果顯