異硫氰酸熒光素fitc

1、異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素(fluesceinisothiocyanateFITC)FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490～495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本

2、中的綠色熒光少于紅色。FITC是一種常用的綠色熒光探針。FITC的吸收(激發(fā))和發(fā)射峰參見(jiàn)下表。FluopheAbsptionPeak(nm)EmissionPeak(nm)FITC492520當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時(shí)，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵(thiocarbe)結(jié)合，形成FITC蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個(gè)IgG分子中有86個(gè)賴氨酸殘基，一般最多能結(jié)合15～20個(gè)，一個(gè)IgG分子可結(jié)

3、合2～8個(gè)分子的FITC，其反應(yīng)式如下FITCN=C=SNH2蛋白質(zhì)→FITCNSCNH2蛋白質(zhì)常用Marsshall(1958)法標(biāo)記熒光抗體，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標(biāo)記法或Clark等(1963)的透析標(biāo)記法。1Marsshall法(1)材料抗體球蛋白溶液、05mol／L(pH90)碳酸鹽緩沖液、無(wú)菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH72或30的001m

4、ol／LPBS等。(2)方法及步驟①抗體的準(zhǔn)備取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5～10min。②熒光素的準(zhǔn)備根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加001mg熒光色素，用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計(jì)算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的

5、量。a蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。b總蛋白量(AXB)＝Crag。cC／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)d熒光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。e巳05mol／L(pH95)碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。fPBS量D(BF)=Gml。注：A為蛋白含量，mg／ml；B為蛋白質(zhì)溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數(shù)，mg；正為熒光素的量，m

6、g；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml。③結(jié)合(或標(biāo)記)邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內(nèi)加完)，加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。④透析結(jié)合完畢后，將標(biāo)記的球蛋白溶液離心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH80緩沖鹽水透析(0～4~C)

7、過(guò)夜。⑤過(guò)柱取透析過(guò)夜的標(biāo)記物，通過(guò)葡聚糖凝膠SephadexG25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定。洗脫液：001mol／L磷酸鹽緩沖液(pH72)；過(guò)濾量：12ml標(biāo)記全球蛋白液(過(guò)濾前未透析)；收集量：20ml(稀釋17倍左右)。2Chadwick法(1)試劑和材料抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、001molLpH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機(jī)及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無(wú)菌吸管，

8、無(wú)菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯（500ml）透析袋等。(2)方法及步驟①抗體準(zhǔn)備用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nèi)，放于冰槽中。②熒光色素準(zhǔn)備按每毫克免疫球蛋白加入熒光素001rug計(jì)算，稱取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解。③將準(zhǔn)備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分?jǐn)噭?，在o～4~C冰箱中結(jié)合(最好在磁力攪拌機(jī)上持續(xù)攪拌)18～24h。④透析和柱層析方法同Marssha

9、ll法。3改良法(1)試劑和材料①001mol／L(pH72)PBS配法中，校定pH至72。NaCi18g、Na2HP04115g，溶于2000ml蒸餾水②05mol／L(pH90)碳酸鹽緩沖液配法取05mol／LNazCOs(53％)10ml加入05mol／LNaHC03(42％)90ml，混合后，校定pH至90。③3％碳酸鈉水溶液配法稱L5g無(wú)水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。④其他試劑和材料l％疊氮化鈉、離心機(jī)及離心管、

10、燒杯(25m1)、攪拌器、無(wú)菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯(500m1)透析袋等。(2)方法及步驟①取高效價(jià)的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(015mol／LNaCl)及緩沖液(05mol／LNaHC03—Na2C03，pH90)稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃。②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白：熒光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C下電磁攪拌12～14h。③然后用半飽和的硫酸銨將標(biāo)

11、記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler試劑測(cè)驗(yàn)，至隔夜透析的鹽水無(wú)氨離子及熒光色素為止)。④將制備好的熒光抗體加疊氮化鈉o01％，分裝在lml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可達(dá)2年以上。4透析標(biāo)記法此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記，標(biāo)記簡(jiǎn)便，非特異性染色較少。(1)試劑和材料試劑和材料同改良法。(2)方法及步驟①用0025mol／L碳酸鹽緩沖液pH90，將欲