灰樹花多糖的FITC熒光標(biāo)記及Caco-2細(xì)胞模型對(duì)其的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)研究.pdf

1、灰樹花多糖（GRN）具有多種生物活性，主要包括抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫特別是細(xì)胞免疫，經(jīng)常與臨床化療藥物合用，在提高藥效同時(shí)可降低藥物的副作用。但是，國(guó)內(nèi)均沒有人對(duì)灰樹花多糖的代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，其主要難點(diǎn)在于缺少高靈敏的灰樹花多糖檢測(cè)手段。擬對(duì)灰樹花多糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，并通過Caco-2細(xì)胞模型對(duì)其吸收與攝入展開研究，為GRN的藥代動(dòng)力深入研究提供幫助。
　　首先，通過Sevag及分步沉淀等方法完成GRN初步純化，再經(jīng)DEAE-纖維素

2、和Sephadex G-100凝膠柱層析純化得到GRN純品，經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定純化后多糖含量為95.7％。
　　其次，利用GRN末端的還原性與酪胺（Tyr）完成還原胺化反應(yīng)，膜分離去除過剩Tyr等小分子，獲得純化的G RN-Tyr共價(jià)偶聯(lián)物，再利用G RN-Tyr中Tyr的氨基基團(tuán)與異硫氰酸熒光素（FITC）進(jìn)行親核反應(yīng)，完成GRN熒光標(biāo)記，最后通過Sephadex G-100柱層析獲得純化的GRN-Tyr-FITC。通過苯酚硫酸

3、法跟蹤檢測(cè)每步反應(yīng)的產(chǎn)物糖原含量；PAGE電泳比較各反應(yīng)產(chǎn)物遷移率（Rx）；紫外光譜掃描跟蹤反應(yīng)產(chǎn)物是Tyr280 nm、F ITC490 nm的特征吸收峰；熒光光譜掃描合成后的GRN-Tyr-FITC最佳激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)。計(jì)算GRN-Tyr-FITC中FITC的取代度，并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明GRN-Tyr、GRN-Tyr-FITC二次標(biāo)記成功；GRN-Tyr-FITC可以熒光定量檢測(cè)（Ex：490 nm，Em：520 nm）

4、，盡管其最佳激發(fā)波長(zhǎng)、最佳發(fā)射波長(zhǎng)均有細(xì)微紅移；GRN-Tyr-FITC可在避光4℃條件下穩(wěn)定保存30天；分批合成的GRN-Tyr-FITC取代度達(dá)0.039%~0.060%（W/W）。
　　最后，選用Caco-2細(xì)胞Transwell單層培養(yǎng)模型，可快速模擬腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)多糖能力。體外建立Caco-2細(xì)胞單層培養(yǎng)模型，并通過檢測(cè)跨膜電阻（TEER）、顯微形態(tài)觀察及標(biāo)志物滲漏方法保證其完整性和緊密性。將GRN-Tyr-FITC制成1

5、00μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL六個(gè)濃度，添加到接種在Transwell上的Caco-2細(xì)胞中，以30min、60min、120min、180min、240min為檢測(cè)點(diǎn)，評(píng)估Caco-2細(xì)胞在頂端側(cè)（AP）到基底側(cè)（BL）方向及基底側(cè)（BL）到頂端側(cè)（AP）方向的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，再次檢測(cè)細(xì)胞跨膜電阻并進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明GRN-Tyr-FITC在AP側(cè)

6、可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，0-4h內(nèi)Caco-2細(xì)胞對(duì)其的攝入量還沒達(dá)到飽和，而在 BL側(cè)濃度600-1000μg/mLGRN-Tyr-FITC在180min后出現(xiàn)了飽和現(xiàn)象。TEER值與實(shí)驗(yàn)前相比變化不大，GRN-Tyr-FITC回收率為64.52%（W/W），回收液中的GRN-Tyr-FITC與對(duì)照組GRN-Tyr-FITC的PAGE電泳電泳遷移率相似。表明Caco-2細(xì)胞的攝入對(duì)GRN-Tyr-FITC的結(jié)構(gòu)無影響，該熒光標(biāo)記方法適用