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文檔簡介
1、目的:研究Caco-2細(xì)胞對異硫氰基熒光素(FITC)標(biāo)記的自組裝海藻酸鈉納米粒(sSAN-FITC)及負(fù)載維生素D3的自組裝海藻酸鈉納米粒(sSAN-VD3-FITC)的攝取及其影響因素,分析sSAN-FITC及sSAN-VD3-FITC通過Caco-2細(xì)胞吸收模型的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)。 方法:1.采用熒光多功能連續(xù)光譜酶聯(lián)免疫分析儀(熒光酶標(biāo)儀)檢測細(xì)胞內(nèi)FITC的熒光強(qiáng)度,觀察分析sSAN-FITC濃度、作用時間、pH值改變對C
2、aco-2細(xì)胞攝入sSAN-FITC的影響。2.采用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡檢測Caco-2細(xì)胞對sSAN-FITC及sSAN-VD3-FITC的攝取,并分析作用時間對攝入的影響;3.采用Caco-2細(xì)胞吸收模型研究sSAN-FITC、sSAN-VD3-FITC的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),利用熒光酶標(biāo)儀檢測接受池內(nèi)溶液中FITC的熒光強(qiáng)度,觀察sSAN-FITC及sSAN-VD3-FITC從腸腔側(cè)(apical,AP)到基底側(cè)(basolateral,
3、BL)的轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)。計算跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)表觀滲透系數(shù)(Papp),并分析作用時間對轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 結(jié)果:1.熒光酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示,加入sSAN-FITC后,細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(p<0.01),且有濃度依賴性和時間依賴性(p<0.01);①與空白對照組相比,不同濃度(50、100、200、400μg/ml)的sSAN-FITC與Caco-2細(xì)胞共同作用2h后,細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度均有不同程度的增強(qiáng),其中200μg/ml組、400μg/ml組
4、細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)顯著(p<0.01);而且與其他各濃度組比較差異顯著(p<0.05,p<0.01),以400μg/ml組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度最高(p<0.001)。②sSAN-FITC與Caco-2細(xì)胞作用不同時間(1h、2h、4h)后細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)(p<0.01,p<0.001);各時間組之間比較差異顯著(p<0.05,p<0.01,p<0.001)。③溶液pH值影響Caco-2細(xì)胞對sSAN-FITC的攝入,當(dāng)溶液pH等于7
5、.0時,細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度最低,當(dāng)pH值低于或高于7.0(6.0、6.5、7.4)時,熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)(p<0.01,p<0.05);溶液pH為6.0時熒光強(qiáng)度最高(p<0.01)。2.熒光顯微鏡照片及激光共聚焦顯微鏡照片顯示,sSAN-FITC、sSAN-VD3-FITC可以被Caco-2細(xì)胞攝入,與細(xì)胞作用1h后,sSAN-FITC大量吸附在細(xì)胞膜上,在細(xì)胞周圍形成綠色熒光環(huán),作用4h后細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量熒光顆粒,熒光強(qiáng)度增強(qiáng);sSAN-
6、VD3-FITC與Caco-2細(xì)胞作用1h后胞漿內(nèi)即出現(xiàn)熒光顆粒,作用4h后,胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。3.跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實驗結(jié)果顯示:①AP-BL轉(zhuǎn)運(yùn)方向,sSAN-FITC與Caco-2細(xì)胞作用不同時間(0.5h、1h、2h、4h)后,接收液內(nèi)的熒光強(qiáng)度、藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量比空白對照組均有不同程度的增強(qiáng)(p<0.05,p<0.01);作用4h后接收液的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)、轉(zhuǎn)運(yùn)量最多(與作用0.5h、1h、2h比較,p<0.01);Papp隨著作用時間的
7、延長逐漸增大,在本實驗研究范圍內(nèi)未有飽和現(xiàn)象。②sSAN-VD3-FITC的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果顯示,在AP-BL轉(zhuǎn)運(yùn)方向接收池內(nèi)液體中FITC的熒光強(qiáng)度、藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量與空白對照組比較均明顯升高,均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01),并且均隨著作用時間的延長,接收液中熒光強(qiáng)度、藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯升高(p<0.01,p<0.05).AP-BL方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Papp較穩(wěn)定,但隨作用時間的延長逐漸減?。虎踫SAN-FITC與sSAN-VD3-FI
8、TC的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)比較,0.5h時sSAN-VD3.FITC接受液內(nèi)熒光強(qiáng)度高于sSAN-FITC.p<0.05)。 結(jié)論:自組裝海藻酸鈉納米粒(sSAN)及負(fù)載維生素D3的自組裝海藻酸鈉納米粒(sSAN-VD3)均可被Caco-2細(xì)胞攝取,攝入時受藥物濃度、藥物作用時間以及藥物溶液pH值的影響,sSAN和sSAN-VD3均可以通過Caco-2細(xì)胞吸收模型從腸腔側(cè)到基底側(cè)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),并存在時間依賴性,表明sSAN和sSAN-VD3
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