重組大腸桿菌表達(dá)熒光素酶的研究.pdf

1、以螢火蟲(chóng)熒光素酶植物表達(dá)報(bào)告載體pXP2為模板，擴(kuò)增得到編碼螢火蟲(chóng)熒光素酶(LUC)的基因(luc)，構(gòu)建了誘導(dǎo)型表達(dá)載體pQE30-luc.轉(zhuǎn)化其宿主菌E.coliM15獲得高效誘導(dǎo)表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的重組菌M15/pQE30-luc.SDS-PAGE電泳分析顯示：重組蛋白的相對(duì)分子量為60kD，表達(dá)量占全菌胞內(nèi)可溶性蛋白的50.9％。 利用表達(dá)載體pQE30上的His-Tag標(biāo)記選用Ni柱純化重組熒光素酶(LUC)，純化

2、后比酶活達(dá)到1.43×109RFU/mg，純化倍數(shù)達(dá)10.6倍，回收率為25.3％。并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，酶反應(yīng)的最適pH為7.5，熱穩(wěn)定性良好，對(duì)光和鹽濃度很敏感，金屬離子Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、NH4+在一定程度上可以促進(jìn)該酶酶活，其中Mg2+促進(jìn)作用最為明顯。 考察了不同的酶保存液對(duì)重組熒光素酶穩(wěn)定性的影響。EDTA、BSA和DTT可以提高酶的穩(wěn)定性，而TritonX-100在低濃度范圍內(nèi)可以保

3、護(hù)熒光素酶，但濃度繼續(xù)升高會(huì)降低熒光素酶的穩(wěn)定性。單因素試驗(yàn)中，EDTA濃度為1.0mmol/L，BSA為0.2％，DTT為4.0mmol/L，TritonX-100為0.2％最有利于酶的穩(wěn)定性。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示：DTT為4.0mmol/L，EDTA為1.5mmol/L，TritonX-100為0.1％，BSA為0.2％最有利于熒光素酶的保存，30D后還可保存89.18％的酶活。 通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件單因素的優(yōu)化，得知重組螢火蟲(chóng)熒光素

4、酶的最佳發(fā)酵條件是：初始pH7.0，裝液量20％，2％的接種量，終濃度為0.5mmol/L的IPTG，添加10～30mmol/L的Mg2+，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，37℃誘導(dǎo)3.5h。在此條件下，螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)量最高。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：初始pH7.0，添加40mmol/LMg2+，接種量2％，裝液量20％時(shí)酶表達(dá)量最高，比酶活達(dá)1.63×108RFU/mg。由重組菌在5L罐上的發(fā)酵曲線可以得知：在5L發(fā)酵罐上的發(fā)酵過(guò)程與搖瓶中發(fā)