人α-防御素基因在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、抗菌肽是生物機(jī)體內(nèi)一類參與防御活動(dòng)的小分子肽。人防御素屬于抗菌肽家族，主要分為α族和β族。人α-防御素(human α-defensin或human neutrophilpcptide，HNP)是近年發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗生素，它具有抗菌和抗病毒等活性。由于其獨(dú)特的抗菌機(jī)制，使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的可能性極大地減少，從而有可能成為新型的抗生素；在其抗病毒活性中，其抗艾滋病毒活性引起了人們的廣泛關(guān)注。利用基因工程方法研制出人僅．防御素已成

2、為人們藥物研發(fā)的目標(biāo)。本學(xué)位論文對(duì)人α-防御素1，2，3基因在大腸桿菌中表達(dá)進(jìn)行了研究。 首先通過半化學(xué)合成方法獲得具有大腸桿菌密碼子偏愛性的3種人α-防御素基因，然后將它們分別克隆到pET-32a(+)，pTWIN1以及pETR表達(dá)載體中，構(gòu)建了9個(gè)相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒。分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，ER2566以及Origami B(DE3)宿主菌株，經(jīng)過表達(dá)條件的優(yōu)化，結(jié)果顯示，在以pET-32a(+)為表達(dá)載體，Orig

3、ami B(DE3)為宿主菌的體系中獲得3種人α-防御素基因高效和可溶性表達(dá)，其融合蛋白表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的60％以上。最佳的表達(dá)條件是：當(dāng)菌體濃度達(dá)到OD<,600>=0．6時(shí)，加入0．5mmol/L IPTG,18℃誘導(dǎo)16h。此外，還對(duì)表達(dá)產(chǎn)物HNP-2進(jìn)行了純化，利用純化產(chǎn)物所作的抗菌實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)抗菌活性。 為了避免表達(dá)產(chǎn)物水解，得到更穩(wěn)定的人α-防御素，以環(huán)化形式和酰胺化形式表達(dá)人α-防御素基因。本研究采用了i

4、ntein作為工具，利用其可剪接extein的特點(diǎn)，將其N端區(qū)域和C端區(qū)域分別融合到目的蛋白編碼序列的C端和N端，目的片段兩端的intein片段就可將其拼接成環(huán)肽，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了環(huán)化表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了研究。HNP-2基因的環(huán)化表達(dá)已獲得了初步結(jié)果。 本研究還采用了1種新的酰胺化方法，即采用intein與HNP融合表達(dá)，intein對(duì)目的短肽進(jìn)行了酰胺化修飾。通過對(duì)HNP-1，HNP-2和HNP-3的研究，在對(duì)HNP-