雪蓮PEBP基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、雪蓮PEBP基因是本實(shí)驗(yàn)室分離出的新抗寒相關(guān)基因，共有510個(gè)核苷酸，網(wǎng)上進(jìn)行BLAST對(duì)比，與擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白基因類似，相似性81﹪。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的Teasy-PEBP質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增PEBP基因，克隆到表達(dá)載體pET30(+)和pPIC9k并導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)和畢赤酵母(Pichiapastoris)GSll5細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物，優(yōu)化表達(dá)條件，主要結(jié)果

2、如下： 根據(jù)pET30(+)多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)PEBP基因特異性引物，引入EcoR I和Nco I酶切位點(diǎn)，以Teasy-PEBP質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增PEBP基因，連接到原核表達(dá)載體pET30(+)上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達(dá)菌株BL21(DE3)，在低溫下，低濃度IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物，Westernblot鑒定目的蛋白，SDS-PAGE分析：其相對(duì)分子量約為28KD，與預(yù)期相符，表達(dá)量約占菌體蛋白的26.8﹪，并且通過(guò)親和層析

3、純化了重組融合蛋白，Western blot鑒定為陽(yáng)性。 根據(jù)pPIC9k多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)PEBP基因引物，分別加入EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，以Teasy-PEBP質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增PEBP基因，克隆到表達(dá)載體pPIC9k，得到重組質(zhì)粒并命名為pPIC9k-PEBP，將pPIC9k-PEBP用Sal I進(jìn)行酶切，線性化后的pPIC9k-PEBP以電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到酵母GS115細(xì)胞中，利用MM和MD平板篩選Mut<'s>(met

4、hanol utilization slow)表型，PCR鑒定重組酵母菌株，乙醇誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析：其相對(duì)分子量約為20KD，蛋白表達(dá)量可占總蛋白的90﹪，上清液抗凍檢測(cè)表明，PEBP能降低液體的冰點(diǎn)，具有一定的抗凍作用。 優(yōu)化重組質(zhì)粒pPIC9k-PEBP在畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115中的表達(dá)條件，初步得到最佳的重組蛋白表達(dá)條件為：誘導(dǎo)劑甲醇濃度為0.5﹪，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH為6.0，誘導(dǎo)溫度為