綿羊早孕因子單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、早孕因子（Early pregnancy factor，EPF）是母體受精后從血清中檢測出最早與妊娠相關(guān)的蛋白，是與妊娠相關(guān)的免疫抑制因子，被認(rèn)為是最早能確認(rèn)妊娠的生化指標(biāo)之一。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，利用早孕因子的特異性可以及時進(jìn)行綿羊的妊娠診斷,減少其空懷發(fā)生，為提高生產(chǎn)效率提供重要意義。同時，EPF還可以跟蹤妊娠母體中胎兒的發(fā)育情況，鑒定胚胎移植效果。
　　目的:應(yīng)用分子生物和細(xì)胞融合技術(shù)制備了綿羊早孕因子重組蛋白和單克隆抗體，為進(jìn)一

2、步研制早孕因子試劑盒奠定基礎(chǔ)。
　　方法:對表達(dá)菌pGEX4t-EPF-BL21(DE)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)劑，對誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行條件優(yōu)化。將表達(dá)出的綿羊早孕因子重組蛋白(EPF-GST)，通過親和吸附層析柱對蛋白進(jìn)行純化，并用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。以純化后的EPF重組蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠，免疫3次，每次免疫時間間隔為15天，后采用間接ELISA方法檢測小鼠效價，取效價合格小鼠(N/P≧2)的脾細(xì)胞，將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)

3、胞進(jìn)行細(xì)胞融合，對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行ELISA方法進(jìn)行篩選，篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞和細(xì)胞株。經(jīng)有限稀釋法將篩選的細(xì)胞株注入小鼠腹腔，用G-sepharose柱親合層析法對小鼠腹水型抗體進(jìn)行純化，應(yīng)用SDS-PAGE和Western blot分析抗體純化后的純度及特異性。
　　結(jié)果:在37℃下，表達(dá)菌最佳優(yōu)化條件為:IPTG濃度0.5mmol/mL，誘導(dǎo)時間4h，在此誘導(dǎo)條件下表達(dá)菌能最大量表達(dá)綿羊EPF重組蛋白，重組蛋白分子量大小為26

4、KD（其中早孕因子蛋白為10KD，標(biāo)簽蛋白為16KD），且該表達(dá)重組蛋白以可溶性形式存在。用純化后的重組蛋白免疫小鼠，小鼠血清效價可達(dá)1∶16000。取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到了1株抗綿羊EPF單克隆抗體的細(xì)胞株B4D5，效價為1∶1000。腹水型抗體經(jīng)G-sepharose柱親合層析，SDS-PAGE和Western blot檢測，得到純度較高的單克隆抗體，且與綿羊EPF具有一定的特異性。
　　結(jié)論:從表達(dá)菌中制備出了