綿羊早孕因子蛋白的表達(dá)及其多克隆抗體的制備.pdf

1、早孕因子（Early pregnancy factor，EPF）是目前在哺乳動物妊娠早期血清中發(fā)現(xiàn)的最早的與妊娠相關(guān)的免疫抑制因子和生長調(diào)節(jié)因子，其可檢測時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于人絨毛膜促性腺激素(HCG)，并且早孕因子對妊娠母體具有很高的特異性，對早孕因子檢測方法的開發(fā)與應(yīng)用對于畜牧生產(chǎn)具有重要意義。
　　目的:應(yīng)用原核表達(dá)技術(shù)制備早孕因子蛋白，將其與弗氏佐劑混合后對家兔進(jìn)行免疫，制備抗早孕因子多克隆抗體，為進(jìn)一步研究開發(fā)早孕因子檢測試劑盒

2、奠定基礎(chǔ)。
　　方法:以妊娠綿羊卵巢組織為樣本提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA，通過PCR擴(kuò)增分別得到帶有EcoRⅠ與XhoⅠ酶切位點(diǎn)和NcoⅠ與XhoⅠ酶切位點(diǎn)的兩條綿羊早孕因子編碼基因。然后進(jìn)行TA克隆，雙酶切反應(yīng)，經(jīng)T4連接酶分別與表達(dá)載體pGEX-4T-1與pET20b重組，并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)感受態(tài)。在異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)下，表達(dá)產(chǎn)生融合GST標(biāo)簽與His標(biāo)簽的早孕因子蛋白。通

3、過GST親和吸附層析柱與Ni親和吸附層析系統(tǒng)得到融合蛋白純品，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot鑒定分析重組蛋白的表達(dá)。使用純化得到的融合GST標(biāo)簽的早孕因子蛋白與弗氏佐劑按等比例混勻后，免疫家兔制備早孕因子多克隆抗體。以融合His標(biāo)簽的早孕因子蛋白為包被原，通過間接ELISA法測定抗體效價(jià)，并通過Western Blot試驗(yàn)檢測血清抗體對早孕因子蛋白的識別、結(jié)合能力。通過臨床試驗(yàn)檢測20只綿羊妊娠情況，進(jìn)行血清抗體實(shí)際應(yīng)用驗(yàn)

4、證。
　　結(jié)果:大腸桿菌原核表達(dá)得到的早孕因子融合GST標(biāo)簽的早孕因子蛋白分子量約為36 kDa，融合His標(biāo)簽的早孕因子蛋白分子量約為12 kDa，與理論值相符。兩種重組早孕因子融合蛋白在大腸桿菌中確實(shí)得到了高效表達(dá)和理想的純化效果，免疫家兔57 d后血清抗體滴度達(dá)到了1∶12000，血清抗體能夠識別早孕因子蛋白，并且血清抗體實(shí)際檢測應(yīng)用檢測正確率達(dá)95％。早孕因子重組子在大腸桿菌中得到了豐富表達(dá)，制備的早孕因子多克隆抗體具有良