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文檔簡介
1、目的:克隆綿羊肺腺瘤病毒受體hyal-2基因全長,將其重組入原核表達(dá)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,進(jìn)而轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)大腸桿菌中,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用親和層析的方法純化出Hyal-2蛋白,制備hyal-2的多克隆抗體,為進(jìn)一步鑒定JSRV感染的組織細(xì)胞,探究JSRV的組織嗜性奠定基礎(chǔ)。
方法:本研究根據(jù)已報道的hyal-2基因序列,經(jīng)primer5.0軟件設(shè)計一對特異性的引物序列,利用PCR方法擴增hyal-2基因序列,并將其重
2、組入pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中,構(gòu)建pGEX-4T-1-hyal-2重組質(zhì)粒,進(jìn)行菌液PCR及測序,鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分析,檢測融合蛋白的表達(dá)情況,經(jīng)Westernblotting驗證融合蛋白的表達(dá)。為了使GST-Hyal-2融合蛋白大量、穩(wěn)定、高效地表達(dá),本試驗分別對重組菌表達(dá)GST-Hyal-2融合蛋白的IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時間、
3、溫度進(jìn)行了優(yōu)化,摸索最佳的表達(dá)條件。進(jìn)而利用谷胱甘肽親和層析的方法對目的蛋白進(jìn)行親和純化,將純化后的目的蛋白免疫家兔,制備Hyal-2蛋白的多克隆抗體,經(jīng)雙向瓊脂擴散實驗測定多克隆抗體的效價,經(jīng)Western blotting檢測多克隆抗體的特異性。
結(jié)果:利用PCR方法成功擴增出了hyal-2基因片段,大小為1431 bp,測序結(jié)果顯示hyal-2基因正確的插入到表達(dá)載體中,成功構(gòu)建了pGEX-4T-1-hyal-2重組質(zhì)粒
4、。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了相應(yīng)預(yù)期大小的Hyal-2融合蛋白,蛋白大小為80 ku,Western blotting也進(jìn)一步驗證了融合蛋白的表達(dá)。利用谷胱甘肽親和層析的方法,純化出了目的蛋白,利用Bradford法測得蛋白濃度為636.1μg/mL,與佐劑充分乳化后,免疫家兔,制備出了兔抗Hyal-2蛋白的多克隆抗體。雙向瓊脂擴散實驗結(jié)果顯示,多克隆抗體的效價達(dá)到了1∶16,經(jīng)Western blotting分析表明制備的多克隆抗體能
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