鮑鐵蛋白、血藍(lán)蛋白原核表達(dá)及多克隆抗體制備、純化.pdf

1、鐵蛋白和血藍(lán)蛋白都是含有金屬離子的多功能蛋白，能直接或者間接的參與生物體內(nèi)重金屬離子的脫毒作用，并參與生物體多種生理生化的反應(yīng)以及各種金屬蛋白和酶類的合成。當(dāng)生物體遭受病原微生物感染時(shí)，鐵蛋白和血藍(lán)蛋白在生物體的表達(dá)量，都有上調(diào)的趨勢(shì)，可見與機(jī)體的免疫密切相關(guān)。
　　 鐵蛋白是由蛋白外殼和鐵核中心組成的一個(gè)具有獨(dú)特籠狀類似于球狀病毒的結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)基本功能是在生物體內(nèi)儲(chǔ)存和釋放鐵離子，有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度，維持鐵離子在細(xì)胞內(nèi)

2、的代謝平衡，避免機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生鐵中毒。鮑的鐵蛋白與脊椎動(dòng)物的鐵蛋白相似，具有兩個(gè)不同的多肽鏈亞基，分別為鐵蛋白亞基l(Abalone ferritin subunit l，AbFel)和鐵蛋白亞基2(Abalone ferritin subunit 2，AbFe2)。
　　 血藍(lán)蛋白是動(dòng)物界中第二大類載氧蛋白，主要分布在軟體動(dòng)物的腹足類、頭足類及節(jié)肢動(dòng)物的甲殼類等的血淋巴細(xì)胞中。鮑血藍(lán)蛋白(Ablonehemocyanin，AbHc

3、)是由二十聚體形成的中凹圓柱型結(jié)構(gòu)，與單孔螺血藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)相似具有兩個(gè)不同的亞基AbHcl和AbHc2，每個(gè)亞基都有8個(gè)功能單位(Functionalunits)，分別命名為a～h，分子量約為400KDa。研究表明，a～h功能體之間的氨基酸序列的同源性超過45％，不同的功能體可能由同一蛋白分子進(jìn)化而來。
　　 本研究選取鮑鐵蛋白兩個(gè)亞基AbFel、AbFe2的ORF序列和鮑血藍(lán)蛋白AbHcHl亞基中FU-d、FU-h功能單位部分序

4、列AbHc-d和AbHc-h，進(jìn)行原核表達(dá)，以弗氏佐劑乳化目的蛋白，采取肌肉多點(diǎn)注射的方法免疫實(shí)驗(yàn)兔；經(jīng)4～5次免疫之后，獲得分別抗AbFel、AbFe2、AbHcld和AbHclh的四個(gè)抗血清。經(jīng)Westernblot檢測(cè)表明，抗AbFel、AbHcld重組表達(dá)蛋白的抗體效價(jià)較低，而抗AbFe2和AbHclh的特異性比較好，AbFel的抗體能識(shí)別AbFe2蛋白；另外，AbHclh和AbHcld的各自抗體都能相互識(shí)別AbHclh和AbH

5、cld蛋白。為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗體的識(shí)別的特異性，采用50％和33％飽和硫酸銨分級(jí)沉淀純化抗血清，并以宿主菌的丙酮提取物去除抗體與宿主菌交叉性反應(yīng)的抗體本底。將經(jīng)飽和硫酸銨粗純化的抗體進(jìn)行Westernblot，本底明顯降低，抗體損失較小，而以宿主菌丙酮提取物去除本底后，抗體效價(jià)大為降低。同時(shí)為了探討了抗體與抗原結(jié)合的最佳工作濃度以及在蛋白亞基之間的抗體識(shí)別的特異性，采用電洗脫的方法回收表達(dá)的目的蛋白，通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)篩選Ab

6、Hcld、AbHclh抗血清與抗原的最佳結(jié)合濃度，結(jié)果顯示抗血清最佳稀釋倍數(shù)為1000倍，抗原濃度分別4μg/mL、2μg/mL。在確定抗體與抗原最佳結(jié)合濃度的基礎(chǔ)上，進(jìn)行這兩個(gè)蛋白與各自抗體的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)抗體的特異性及非特異識(shí)別的程度。
　　 本研究通過制備鐵蛋白亞基AbFel、AbFe2和血藍(lán)蛋白AbHcHl亞基的FU-d、FU-h功能體的多克隆抗體，檢測(cè)蛋白多聚體亞基之間的識(shí)別特異性，為進(jìn)一步驗(yàn)證鮑宿主在病原