pET32a-XBP1u蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備.pdf

1、研究目的: 真核細(xì)胞中X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein1，XBP1）作為一種轉(zhuǎn)錄活化因子發(fā)揮著多種不同的功能，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，參與機(jī)體的多種生理及病理過程，其對疾病發(fā)生及發(fā)展的影響是近年來研究的熱點(diǎn)。本研究首先運(yùn)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、基因克隆等分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET32a-XBP/u，通過將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21，得到大量包涵體表達(dá)的目的蛋白XBP1u，利用Nj2

2、+-NTA樹脂對目的蛋白進(jìn)行純化，之后進(jìn)一步應(yīng)用Western blot對純化的目的蛋白進(jìn)行分析，以鑒定得到的純化XBP1u蛋白，用該純化蛋白免疫家兔制備抗XBP1u多克隆抗體，從而為進(jìn)一步研究XBP1u的生物學(xué)功能及其他相關(guān)后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 研究方法: （1）使用總RNA提取試劑盒（TRIZOL試劑盒）從肝癌細(xì)胞（HepG2）中提取總RNA，并利用RT-PCR兩步法擴(kuò)增出目的片段XBP1u。 （2）利用分子克

3、隆技術(shù)將目的基因克隆到pGEM-T載體上，構(gòu)建成重組載體pGEM-T-XBP1u。 （3）利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-XBP1u。 （4）將重組載體pET32a-XBP1u轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21，用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌大量表達(dá)，得到目的蛋白XBP1u，SDS-PAGE分析其表達(dá)形式，并利用Ni2+-NTA樹脂對目的蛋白進(jìn)行純化，之后用BCA法測定所表達(dá)的目的蛋白濃度。 （5）利用We

4、stern blot鑒定目的蛋白的正確性。 （6）用純化后的目的蛋白作為抗原免疫家兔制備多克隆抗體。 （7）ELISA檢測兔抗XBP1u血清的效價(jià)。 （8）Western blot檢測兔抗XBP1u血清的特異性。 研究結(jié)果: （1）擴(kuò)增出了目的基因片段XBP1u，經(jīng)測序XBP1u由785bp組成，為編碼261個(gè)氨基酸殘基的多肽。 （2）成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a-XBP1u，并轉(zhuǎn)化

5、入大腸桿菌E.coli BL21。 （3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)后，SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白相對分子量為33KD，主要以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)NI2+-NTA柱純化后，純度達(dá)90％以上，BCA法測得蛋白質(zhì)含量為1.42mg/ml。 （4）Western blot對目的蛋白進(jìn)行分析，由于重組載體pET32a-XBP1u中的pET32a帶有His標(biāo)簽，因此可以采用anti-His抗體和anti-XBP1u抗體同時(shí)檢測XB