人CL-L1基因片段的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備.pdf

1、背景與目的:人肝臟膠原樣凝集素-1(collectin liver1,CL-L1)基因首先由Ohtani等克隆獲得,為膠原樣凝集素家族的新成員。推測(cè)該序列具有典型的膠原樣凝集素特點(diǎn),由N端富含半胱氨酸區(qū)、膠原樣區(qū)、頸區(qū)和糖識(shí)別區(qū)(carbohydrate recognitiondomain,CRD)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)的膠原樣凝集素多數(shù)為分泌蛋白,是固有免疫的重要分子,它們通過(guò)凝集病原微生物、激活補(bǔ)體、調(diào)理作用、激活吞噬作用和抑制病原生長(zhǎng)等參與

2、機(jī)體的免疫防御反應(yīng)。但CL-L1為唯一發(fā)現(xiàn)的胞漿內(nèi)蛋白,對(duì)它在人體組織表達(dá)譜及功能了解較少。為此,本研究構(gòu)建了CL-L1的頸區(qū)-糖識(shí)別區(qū)原核表達(dá)質(zhì)粒,在E.coli BL21中表達(dá),經(jīng)親和層析純化,免疫家兔制備了多克隆抗體,為進(jìn)一步研究CL-L1在人體組織表達(dá)譜及其結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法:從已構(gòu)建的含有全長(zhǎng)CL-L1基因序列的pcDNA3.1/myc-His-CL-L1重組載體中,采用PCR方法擴(kuò)增人CL-L1頸區(qū).糖識(shí)別

3、區(qū)目的基因片段,將目的片段平端插入pT7 blue克隆載體,酶切獲得目的片段定向插入pRSET-C中,構(gòu)建原核表達(dá)載體,在E.coli BL21中進(jìn)行原核表達(dá),鎳親和層析柱純化融合蛋白,免疫家兔,制備多克隆抗體。采用ELISA檢測(cè)抗體效價(jià),免疫印跡法檢測(cè)蛋白純度和抗體的特異性。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了人CL-L1頸區(qū)-糖識(shí)別區(qū)原核表達(dá)載體pRSET-C/NECK-CRD△K,在E.coli BL21中表達(dá),鎳親和層析柱純化,得到相對(duì)