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文檔簡介
1、白細胞介素(IL)-33 是2005年Schmitz 等使用計算機序列分析、發(fā)現(xiàn)并鑒定的一種前炎癥細胞因子。它的基因序列和結構與IL-1 家族成員IL-1 β和IL-18 最為相似,屬于IL-1 家族的一個新成員,也被稱為IL-1F11。IL-33 mRNA 在小鼠胃、肺、脊髓、腦、皮膚等組織及靜止樹突狀細胞、活化的巨噬細胞高表達,在人平滑肌細胞及支氣管或小氣道上皮細胞為組成性表達。IL-33與其受體ST2 結合,活化核因子(NF)-κ
2、 B和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK),誘導輔助性T 細胞(Th)2 細胞因子的產(chǎn)生,在多種炎癥與免疫過程中發(fā)揮重要作用。
目前,關于IL-33 功能的研究在國內(nèi)外都尚處于發(fā)展階段。本研究用分子生物學技術克隆小鼠IL-33基因,通過構建其真核及原核表達載體、原核表達系統(tǒng)表達IL-33 蛋白及其兔抗多克隆抗體的制備,探討小鼠IL-33 蛋白在不同組織中的表達分布及IL-33 在不同疾病動物模型中的作用,為進一步研究其功能奠定
3、了基礎。本文主要研究內(nèi)容如下:
一、根據(jù)GenBank中小鼠IL-33基因序列(No. AY905582)設計特異性引物,用逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)技術,克隆出IL-33基因的全長編碼區(qū)。將其克隆入pcDNA3.1(+)載體,構建其真核表達載體pcDNA3.1(+)-mIL-33,之后將該表達載體轉化入大腸桿菌TOP10中,經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定及序列測序,得知它與GenBank中的序列完全一致,為IL-33基
4、因的表達研究奠定了基礎。
二、根據(jù)小鼠IL-33基因序列設計特異性引物,用PCR 技術,克隆出IL-33 成熟蛋白編碼區(qū),將其克隆入載體pET-44,構建原核表達載體pET-44-mIL-33,經(jīng)測序鑒定其編碼基因與GenBank中的序列一致。將該表達載體轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中獲得表達菌株,然后在25°C 用IPTG 誘導,表達的融合蛋白以可溶性蛋白及包涵體形式存在。用鎳離子親和層析法純化以可溶性形式存在的目的
5、蛋白,經(jīng)凝膠圖像分析確定其純度可高達95%以上。
細胞增殖實驗結果表明,重組IL-33 蛋白具有抑制細胞增殖的活性,且其活性比標準品高。
三、利用純化的IL-33 蛋白,免疫新西蘭白兔,制備兔抗小鼠IL-33 多克隆抗體,ELISA結果顯示,該多克隆抗體效價高達1:32 000 ;Western blot 結果顯示,該多克隆抗體可以與小鼠IL-33 蛋白特異性結合。免疫組織化學染色結果顯示,小鼠IL-33 蛋
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