分枝桿菌Ag85B的原核表達及其多克隆抗體的制備.pdf

1、一、目的BCG膀胱灌注是治療膀胱腫瘤防止其復發(fā)的最有效方法之一,但目前在治療中存在著給藥量大、療效不確切、易導致結(jié)核播散等并發(fā)癥,提示著必須對這一方法進行改造.Ag85B是結(jié)核桿菌的主要分泌蛋白之一,是結(jié)核桿菌的主要保護性抗原.Ag85B基因的發(fā)現(xiàn)為膀胱腫瘤的治療提供了一條新的線索,利用分枝桿菌Ag85B的免疫原性,在膀胱癌及其它腫瘤治療中的應用研究近年來受到重視.本科室正利用Ag85B基因?qū)Π螂啄[瘤的治療進行進一步的研究,希望找到一種

2、治療膀胱腫瘤的新的有效方法.該實驗的目的是制備兔抗Ag85B多克隆抗體, 為相關(guān)的研究提供實驗室素材,用來鑒定融合蛋白內(nèi)或組織里的Ag85B蛋白.二、研究內(nèi)容及結(jié)果該研究中首先構(gòu)建編碼結(jié)核分枝桿菌Ag85B分泌蛋白的重組表達質(zhì)粒,將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌,誘導表達融合蛋白并加以純化;然后將純化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗體血清,純化制備多克隆抗體并進行鑒定.主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.用EcoRI和SalI雙酶切,從pUC18-Ag85B質(zhì)

3、粒上切下Ag85B基因片段,然后將該片段插入經(jīng)過同樣雙酶切的融合表達載體pGEX-4T-1中,構(gòu)建重組pGEX-Ag85B質(zhì)粒.酶切鑒定及測序結(jié)果表明,成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pGEX-Ag85B;2.將pGEX-Ag85B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,重組基因工程大腸桿菌發(fā)酵后,用IPTG誘導表達GST-Ag85B融合蛋白,其主要是以包涵體的形式存在,洗滌包涵體進行初步純化,將包涵體進行變性和緩慢稀釋復性,用Sepharose Hig

4、h Performance離子柱分離純化,SDS-PAGE電泳分析該蛋白純度達到了95﹪以上;3.將純化的GST-Ag85B融合蛋白作為抗原,在與佐劑乳化后,免疫家兔共4次,抽取家兔的抗血清,用鹽析法粗提IgG多克隆抗體,離子交換法進一步純化抗體.酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)鑒定抗體,證明制備的多克隆抗體可以與 GST-Ag85B融合蛋白相結(jié)合,產(chǎn)生抗原-抗體反應.4.利用Ag85B多克隆抗體對本科室制備的Ag85B/IL-2融合蛋白進