鹿源牛結(jié)核分枝桿菌ESAT--6、Ag85b蛋白的表達(dá)與純化及抗原特異性研究.pdf

1、結(jié)核病是在全球范圍內(nèi)廣泛傳播的一種慢性、消耗性人畜共患傳染病。鹿結(jié)核病主要由牛型結(jié)核分枝桿菌和人型結(jié)核分枝桿菌引起，不僅給養(yǎng)鹿業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，同時也是人結(jié)核病的主要傳染源。
　　目前皮內(nèi)結(jié)核菌素(PPD)試驗是診斷動物結(jié)核病的主要方法。但是鹿在接種卡介苗(BCG)后，PPD試驗反應(yīng)的特異性受到嚴(yán)重干擾，無法將BCG接種鹿與野毒株感染鹿區(qū)分開來。迄今為止，尚無有效的方法確診野毒感染鹿結(jié)核病。研究表明，ESAT-6是結(jié)核病強(qiáng)毒株特有的

2、特異性抗原，可用作自然感染鹿結(jié)核病的診斷抗原。Ag85是結(jié)核分枝桿菌最主要的分泌蛋白，有較好的抗原性。因此，本研究旨在通過表達(dá)純化出ESAT-6和Ag85b，制備成能有效鑒別野毒感染與疫苗接種鹿的抗原，進(jìn)而建立起快速檢測鹿結(jié)核病的早期診斷方法。
　　利用由結(jié)核病鹿肺組織中分離鑒定出的牛結(jié)核分枝桿菌染色體為模板，分別克隆出ESAT-6和Ag85b基因，將兩種基因分別連接到pNC-HisE載體，構(gòu)建出ESAT6-pNC-HisE和Ag

3、85b-pNC-HisE表達(dá)載體。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過新霉素抗性平板篩選，以及PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，成功研制出表達(dá)ESAT-6和Ag85b的枯草芽孢桿菌工程菌株。
　　將枯草芽孢桿菌工程菌株接種于新霉素抗性培養(yǎng)基中，應(yīng)用枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)，分泌性表達(dá)目標(biāo)蛋白，分別利用ESAT-6和Ag85b單抗，采用Western Blot方法檢測，證明成功表達(dá)出ESAT-6和Ag85b。
　　取枯草芽孢桿菌工程

4、菌培養(yǎng)物上清，經(jīng)超濾粗分離后，應(yīng)用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，利用鎳瓊脂糖凝膠FF柱，對上清中帶有His標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離純化。純化產(chǎn)物通過SDS-PAGE分析和Western Blot鑒定，表明已分別純化出ESAT-6和Ag85b。
　　應(yīng)用斑點(diǎn)雜交方法，利用鹿結(jié)核病、鹿副結(jié)核病、鹿壞死桿菌病、鹿布氏桿菌病、鹿大腸桿菌病、鹿魏氏梭菌病的陽性血清，對純化出的ESAT-6和Ag85b的抗原特異性進(jìn)行評價，實(shí)驗結(jié)果表明，ESAT-6和A