表達(dá)結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合抗原與IL-21核酸疫苗構(gòu)建及免疫效果研究.pdf

1、結(jié)核?。═B）是由結(jié)核分枝桿菌（MTB）引起的慢性傳染病，仍然是威脅人類(lèi)健康的三大感染性疾病之一。目前全世界大約有20億人被MTB感染，每年超過(guò)200萬(wàn)人死于結(jié)核病。盡管在全球范圍內(nèi)進(jìn)行了大規(guī)?？ń槊缃臃N以預(yù)防結(jié)核病，然而隨著人口流動(dòng)的增加、多重耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)、結(jié)核分枝桿菌合并HIV病毒感染以及卡介苗接種防護(hù)的自身局限性等原因，自20世紀(jì)以來(lái)，結(jié)核病的發(fā)生率在全球呈明顯的上升趨勢(shì)。 傳統(tǒng)的結(jié)核病疫苗是卡介苗（BCG），雖然可

2、有效預(yù)防兒童結(jié)核病尤其是結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生，但對(duì)成人結(jié)核病的預(yù)防作用甚微，對(duì)免疫功能低下或免疫缺陷患者使用卡介苗則可引起嚴(yán)重的散播性結(jié)核病，其對(duì)人體的保護(hù)效力在0％～80％之間。鑒于卡介苗本身的局限性，研究和開(kāi)發(fā)一種更有效、安全、適合各類(lèi)人群使用的新型結(jié)核病疫苗勢(shì)在必行。 實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中成功構(gòu)建了結(jié)核菌Ag85A與IL-21共表達(dá)核酸疫苗，實(shí)驗(yàn)證明共表達(dá)核酸疫苗免疫組小鼠的CTL活性明顯增強(qiáng)、特異性淋巴細(xì)胞明顯增殖、NK細(xì)

3、胞殺傷活性與對(duì)照組相比有一定提高。在此基礎(chǔ)上，我們用真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES作為載體，構(gòu)建Ag85A-ESAT-6融合基因與IL-21共表達(dá)核酸疫苗，研究其誘導(dǎo)小鼠的免疫效應(yīng)，為下一步該核酸疫苗抗結(jié)核桿菌感染的研究奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分： 一、結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達(dá)核酸疫苗的構(gòu)建及體外表達(dá)的鑒定 目的：利用真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES，構(gòu)建結(jié)核桿菌Ag85A、ESAT-6融合基因與細(xì)胞因

4、子IL-21共表達(dá)核酸疫苗pIRES-IL21-Ag85A-ESAT-6，并在骨髓瘤細(xì)胞（SP2/O）中表達(dá)。方法：先用PCR方法從本室保存的重組質(zhì)粒pIRES-Ag85A中擴(kuò)增出Ag85A基因序列并插入到質(zhì)粒pIRES-ESAT-6上成為plRES-Ag85A-ESAT-6，再用PCR方法從pRSC-IL-21重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出IL-21基因，構(gòu)建于pIRES-Ag85A-ESAT-6重組質(zhì)粒上，成為共表達(dá)核酸疫苗pIRES-IL21-

5、Ag85A-ESAT-6。結(jié)果：經(jīng)酶切、基因測(cè)序、RT-PCR證實(shí)重組核酸疫苗構(gòu)建正確并能成功表達(dá)目的基因。結(jié)論：成功構(gòu)建了結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達(dá)核酸疫苗，為進(jìn)一步研究其免疫效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。 二、結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達(dá)核酸疫苗誘導(dǎo)C57BL/6小鼠免疫應(yīng)答的初步研究 目的：研究結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達(dá)核酸疫苗類(lèi)似物對(duì)

6、小鼠免疫功能的影響。方法：將100μg重組質(zhì)粒免疫小鼠，共三次，每次間隔兩周，總共300μg/只鼠。通過(guò)NK細(xì)胞活性、脾細(xì)胞細(xì)胞毒作用、脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)、以及小鼠血清抗體、IFN-γ和IL-4水平的檢測(cè)，評(píng)價(jià)結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表達(dá)核酸疫苗的免疫效果。結(jié)果：pLRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6核酸疫苗免疫鼠的NK細(xì)胞活性、脾細(xì)胞細(xì)胞毒作用、脾細(xì)胞增殖反應(yīng)及IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組，差異有顯