結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白在畢赤氏酵母中的融合表達(dá)及其活性研究.pdf

1、ESAT-6蛋白是從結(jié)核分支桿菌短期培養(yǎng)濾液(ST-CF)中純化分離出的一種含有95個氨基酸的分子量約為9.9kD的分泌性蛋白。在遠(yuǎn)交系豚鼠模型和牛TB動物模型中，ESAT-6蛋白是免疫回憶效應(yīng)性T細(xì)胞的主要靶抗原之一，可在再次結(jié)核感染的早期誘導(dǎo)其迅速增殖和釋放高水平的IFN-γ，從而有效地激活巨噬細(xì)胞。而將ESAT-6蛋白輔以佐劑一磷?；|(zhì)A(MPL)制成亞單位疫苗，可誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性T細(xì)胞反應(yīng)和與BCG相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)效應(yīng)。因此，E

2、SAT-6蛋白可作為亞單位疫苗的組分或成為DNA疫苗的候選抗原以達(dá)到對TB長期、有效的預(yù)防?！　榱双@得ESAT-6蛋白的高效分泌表達(dá)，本文首先嘗試將esat-6基因直接轉(zhuǎn)入pichiapastorisGS115菌株中，但表達(dá)水平極低。由于α干擾素已經(jīng)在酵母中成功地實現(xiàn)了高表達(dá)，因此作者嘗試將α-2a干擾素和ESAT-6蛋白融合表達(dá)，既可以利用ESAT-6蛋白的免疫原性刺激人體產(chǎn)生抗體，又可以發(fā)揮干擾素的抗病毒和增強(qiáng)免疫力的功效。將人

3、α-2a干擾素基因、結(jié)核分枝桿菌esat-6基因經(jīng)PCR擴(kuò)增并加上相應(yīng)的酶切位點，以腸激酶識別的DNA序列作為接頭，插入到分泌型載體pPIC9k中去。將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入pichiapastorisSMD1168中，采用G418梯度篩選獲得高抗性轉(zhuǎn)化子。挑選高抗性轉(zhuǎn)化子作搖瓶發(fā)酵，以甲醇作為誘導(dǎo)物，發(fā)酵4天后取上清，經(jīng)Phenyl-sepharose6(FastFlow)疏水層析柱和DEAE-SepharoseF.F離子交換柱初步純化，S